水解贝壳硬蛋白美白功效的初步研究

《水解贝壳硬蛋白美白功效的初步研究》论文发表期刊：《药物生物技术》；发表周期：2021年03期

《水解贝壳硬蛋白美白功效的初步研究》论文作者信息：陆垚嘉，女，浙江湖州人，大学本科，浙江欧诗漫生物股份有限公司技术研发部技术员，主要方向: 珍珠应用基础研究。王菁，女，浙江兰溪人，硕士研究生，浙江欧诗漫生物股份有限公司技术研发部副部长，主要方向: 珍珠应用基础研究。

　　摘 要 研究水解贝壳硬蛋白( Shell protein extract，SPE) 对 B16 细胞内黑色素含量及酪氨酸酶活性的影响。培养 B16 细胞，构建 α-黑素细胞刺激素( α-MSH) 诱导细胞的黑色素高表达量细胞模型。SPE 作用 B16 细胞， CCK8 法测定细胞活力; NaOH 裂解法和 L-DOPA 氧化法测定细胞内黑色素含量和酪氨酸酶活性的变化。结果显示，SPE 在 1，0. 1 g /L 时，对细胞无毒性作用; 与阳性对照熊果苷相比，SPE 对黑色素含量和酪氨酸酶活性的抑制作用与熊果苷基本一致，表明 SPE 的美白效果与普遍认可的美白添加剂熊果苷的效果一样。

　　关键词 水解贝壳硬蛋白; B16 细胞; 黑色素; α-黑素细胞刺激素; 酪氨酸酶

　　当前化妆品领域，美白是消费者追求的热门话题，目前市场上常见的美白活性物质有熊果苷、曲酸、甘草提取物等。其中曲酸的副作用比较强，对细胞有一定的毒性，长期使用可能会致癌"：酪氨酸是一种广泛存在于人体中的氧化酶2，它能把酪氨酸氧化成为多巴醒，再经过一系列的生化过程，最终生成为黑色素四。黑素细胞中酪氨酸酶在黑色素的生成过程中起到催化作用，是主要的限速酶[，如果添加外界物质在一定程度上抑制酪氨酸酶的活性，就可以减少黑色素的生成，起到美白的效果。熊果苷和甘草提取物的美白效果都是通过抑制酪氨酸酶活性，从而达到减少黑色素含量，最终起到美白效果[5]，这一类美白活性物质比较受消费者的喜欢。

　　a-MSH通过与黑色素细胞表面黑色素1受体(Melano-

　　cortin-l recptor，MC-R)的结合，促进黑色素细胞树突的形成、酪氨酸酶表达量增加以及活性增强、黑色素细胞的增殖，最终促进黑色素的生成，因此在一些美白活性物质的实验中，a-MSH通常做为黑色素合成的刺激素。

　　珍珠主要由95%的碳酸钙和5%的角壳蛋白组成回，通过对珍珠的深加工发现珍珠在美容方面具有美白、抗氧化等功效。如张丽华等[发现珍珠提取物具有很显著的体外抗氧化能力;杨安全等"1发现珍珠提取物能抑制B16F10细胞的酪氨酸酶活性，且能减少黑色素的生成，说明珍珠提取物有美白的效果。珍珠母和珍珠同源生长，除碳酸钙晶型有所区别外，其中的有机质例如蛋白质相似度较高，目前珍珠母中蛋白提取物的功效研究还没有报道过，作者推测珍珠母提取物有和珍珠提取物相似的功效，本文以B16为受试细胞，采用CCK8法研究珍珠母中不同浓度的水解贝壳硬蛋白对细胞的增殖影响，初步研究了水解贝壳硬蛋白对酪氨酸酶活性以及黑色素含量的影响，为新一代美白化妆品原料的开发提供理论依据，也为珍珠母的深加工开发利用提供数据支持。

　　1材料

　　1.1 样品来源

　　水解贝壳硬蛋白(SPE)：三角帆蚌贝壳于研磨机中研磨成粉，溶解后脱钙取贝壳硬蛋白，进行水解，过滤取上清液后冻干，蛋白质量分数45%~55%。

　　1.2 药品与试剂

　　胎牛血清FBS，购自浙江天杭生物科技股份有限公司;PBS缓冲液(pH =7.4)，购自北京索莱宝科技有限公司;

　　0.25%胰蛋白酶(0.02%EDTA)，青链霉素溶液，DMEM培养液，均购自杭州科易生物技术有限公司：CCK-8，Triton X-100，均购自美国Sigma公司;多巴溶液(L-DOPA)，熊果苷，均购自阿拉丁;二甲基亚砜(DMSO)，乙醇，乙醚，氢氧化钠，均购自国药集团化学试剂有限公司。

　　1.3仪器

　　酶标仪，美国MD公司：C02培养箱(BB150)，-81 ℃冰箱，赛默飞世尔科技公司; 倒置显微镜( CKX41) ，奥林巴斯(中国)有限公司。

　　1.4细胞株

　　B16黑色瘤细胞株购买于上海中科院细胞所。

　　2方法

　　2.1 B16细胞的培养和分组

　　B16细胞置于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养液中培养，培养条件为37 ℃.5%C02培养，取对数生长期的细胞用于后续的实验。实验分组：空白对照组(Con-

　　trol)，a-MSH模型组(Model)，阳性对照组(a-MSH诱导+

　　熊果苷1.36 g/L)，SPE组(a-MSH诱导+SPE1，0.1 g/L)。

　　2.2 B16细胞活力的测定实验

　　采用CCK8法测定B16细胞的活力。取B16细胞调节至5 x 10个/mL，配成单细胞悬液，加入96孔板，每孔100 L，置于37 ℃.5%co2培养箱中培养24 h后，按照分组加入不同药物，每组6个平行，培养24 h后去上清液，用PBS清洗一遍，每孔加入100 uL培养液，再每孔加入10 ul CCK8溶液，放入培养箱作用2h后，在酶标仪上，以双波长450 nm和650 nm测定各孔的吸光值。B16细胞的细胞存活率计算方法：

　　2.3 B16细胞内黑色素含量的测定实验[2

　　采用NaOH裂解法测定B16细胞内黑色素的含量。按照5 x 10"个/mlL.的细胞密度进行6孔板接种，每孔加入2 ml，培养液，37 ℃，5%CO2培养箱，培养24 h后，按照分组加入不同药物，每组3个平行，37 ℃，5%C02培养箱培养24 h后弃上清，使用胰酶消化收集细胞，加入300 L，1 mol/L NaOH(含10%DMSO)，于80℃水浴反应40 min，使黑素颗粒完全溶解，收集到96孔板，每孔200 uL，于酶标仪波长405 nm处测各孔的吸光值。B16细胞内黑色素含量抑制率计算方法：

　　2.4 B16细胞内酪氨酸酶活性的测定实验[3

　　采用L-DOPA氧化法测定B16细胞内酪氨酸酶的活性。按照5 x 10"个/ml.的细胞密度进行96孔板接种，每孔加入100 山培养液，37 ℃，5%co2培养箱，培养24 h后，按照分组加入不同药物，每组6个平行，37℃，5%co2培养箱培养24 h后，弃去上清液，用PBS洗涤3次，每孔加质量分数为1%的辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X400)溶液50 L，迅速置于-81 ℃冻存30 min，随后室温融化使细胞完全破裂，37 ℃预温5 min后加入质量分数为1%的L-

　　DOPA溶液10 L，37 ℃反应2 h，在酶标仪490 nm处测其吸光值。B16细胞内酪氨酸酶活性抑制率计算方法：

　　2.5 数据分析

　　数据采用Graphpad Prism8软件进行分析，以标准差

　　(i±s)表示，用1Hest检验差异的显著性，P<0.05表示具有显著性。

　　3结果

　　3.1 SPE对B16细胞活力的影响由图1可知，B16细胞经不同浓度的SPE(1，0.1 g/L)

　　作用24 h后，SPE对细胞的生长没有明显的影响，与空白对照组相比(Control)，统计学上无显著性差异(P>0.05)。

　　因此表明，后续实验可用这两个浓度进行研究。

　　3.2 SPE对a-MSH诱导的B16细胞黑色素含量的影响

　　由图2可知，B16细胞经过a-MSH的诱导，细胞内黑色素的含量明显增加(P<0.05)，表明a-MSH诱导的细胞黑色素高表达量模型建立成功。与a-MSH模型组相比，阳性对照熊果昔作用后，细胞内黑素含量明显降低，生成抑制率为

　　(15.16 ±2.42)%：而SPE组，当作用质量浓度为1，0.1 g/L时，对黑色素含量的生成抑制率分别为(17.30±4.47)%

　　(11.88 1 10)%，与a-MSH模型组相比，具有显著性差异

　　(P <0.05，P<0.01)。结果表明，当SPE质量浓度为1g/L时对黑色素生成抑制作用与阳性对照熊果苷基本一致。

　　3.3 SPE对a-MSH诱导的B16细胞酪氨酸酶活性的影响

　　由图3可知，SPE和阳性对照熊果苷对B16细胞内酪氨酸酶活性都呈现出明显的抑制作用。a-MSH模型组相比，SPE在1，0.1 g/L时，酪氨酸酶活性的抑制率分别为

　　(15.96 ±6.72)%、(23.90 ±8.45%);而阳性对照熊果苷的抑制率为(23.86±7.04)%。结果显示，SPE对B16细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用与阳性对照熊果苷基本一致。

　　4讨论

　　研究以B16细胞为研究对象，构建a-MSH诱导细胞的黑色素高表达量细胞模型。首先研究SPE对细胞活力的影响，结果显示，SPE在质量浓度为1，0.1 g/L时，对细胞无毒性作用，具有较高的安全性，可用这两个浓度进行后续的实验研究。以熊果苷为阳性对照，本研究检测了SPE对a-

　　MSH的细胞内黑色素含量及酪氨酸酶活性的影响。结果显示，细胞经a-MSH的诱导，细胞内黑色素含量和酪氨酸酶活性明显增加，与空白对照组相比，具有显著性差异，表明a-MSH诱导的细胞黑色素高表达量模型建立成功。SPE对a-MSH诱导细胞内黑色素含量和酪氨酸酶活性均有抑制作用，与阳性对照熊果苷相比，SPE对黑色素含量和酪氨酸酶活性的抑制作用和熊果苷基本一致。研究中SPE主要通过抑制酪氨酸酶的活性来起到降低黑色素的含量，至于SPE的具体成分分析、具体哪种成分在起作用以及具体通过哪种信号途径起到降低黑色素的含量，这些问题在今后的研究中会继续挖掘。研究表明，SPE作为一种化妆品原料，在一定浓度范围内具有一定的生物安全性，其美白效果与普遍认可的美白添加剂熊果苷基本上一致。

　　参考文献

　　[1] You A, Zhou J, Song S, et al. Rational design , synthesis and structure-activity relationships of 4-alkoxy-and 4-acyloxyphenylethyl enethiosemicarbazone analogues as novel tyrosinase inhibitors LJ]. Bioorganic Med Chem, 2015, 23 (5) :924931.

　　[2] Kubo I, Kinst-Hori I, Kubo Y, et al. Molecular design of antibrowning agents [J]. J Agricul Food Chem, 2000, 48 (4):13931399.

　　[3] Seo SY, Sharma VK, Sharma N. Mushroom tyrosinase: recent proSPEcts [1] .J Agricul Food Chem, 2003,51 (10) :28372853.

　　[4] J. P Césarini, I. N S E R M. Melanins and their possible roles through biological evolution [J] . Advances Space Res, 1996, 18(12) :35-40

　　[5] Chakraborty AK, Funasaka Y, Komoto M, et al. Effect of arbutin on melanogenic proteins in human melanocytes [J]. Pigment Cell Research, 1998,11 (4) :206-212.

　　[6] Sturm RA, Teasdale RD, Box NF. Human pigmentation genes: identification, structure and consequences of polymorphic variation[J]. Gene, 2001 , 277 (1) :49-62.

　　[7]Suzuki 1，Cone RD，Im S，et al.Binding of melanotropic hormones to the melanocortin receptor MCI R on human melanocytes stimulates proliferation and melanogenesis[J].Endocrinology，1996，13(5)：16274633.

　　[8]Moragot Chatatikun，Takeshi Yamauchi，Kenshi Yamasaki，et al.Phyllanthus acidus(L.)Skeels and Rhinacanthus nasutus(L.)Kurz leaf extracts suppress melanogenesis in normal human epidermal melanocytes and reconstitutive skin culture[J].Asian Pacific J Tropical Med，2019，12(03)：98405.

　　[9]杨明月，郭守国，史凌云，等，淡水养殖珍珠的化学成分与呈色机理研究[J].宝石和宝石学杂志，2004，(02)：10-43.

　　[10]张丽华，沈玥琦，杨安全，等，珍珠提取物冻干粉的体外抗氧化功效研究[].香料香精化妆品，2018，(04)：2629.

　　[11]杨安全，王菁，沈玥琦，等，珍珠提取物对黑色素细胞酪氨酸酶活性和黑色素合成的影响[].药物生物技术，2018，25(04)：312-315.

　　[12]Nouha Nasr Bouzaiene，Fadwa Chaabane，Aicha Sassi，et al.Effect of apigenin-7-glucoside, genkwanin and naringenin on tyrosinase activity and melanin synthesis in B16F10 melanoma cells [J]Life Sciences, 2016, 144.

　　[13] Kim A, Yim NH, Im M, et al. Ssanghwa-tang, an oriental herbal cocktail, exerts anti-melanogenie activity by suppression of the 38 MAPK and PKA signaling pathways in B16F10 cells [J]Bmc Complementary Alternative Med, 2013, 13 (1) :214.