蚊媒病毒病流行现状及病原学检测技术研究进展

《蚊媒病毒病流行现状及病原学检测技术研究进展》论文发表期刊：《中国病原生物学杂志》；发表周期：2021年06期

《蚊媒病毒病流行现状及病原学检测技术研究进展》论文作者信息：曾嘉庆（１９９７－），男，江苏沛县人，在读硕士研究生，主要从事分子病毒学研究。

　　【摘要】 新发再发蚊媒病毒病在病原-媒介-宿主之间传播，引起登革热、寨卡热及流行性乙型脑炎等多种流行病，严重威胁着人类和动物的生命健康。本文主要总结了常见蚊媒病毒病流行特征，重点综述了蚊媒病毒病原学检测的优缺点与适用范围。

　　【关键词】 蚊媒病毒病;检测技术;登革热;寨卡热;流行性乙型脑炎;综述

　　[ Abstract] Emerging and re-emerging mosquito-borne viral diseases spread between pathogens, vectors, and hosts, causing a variety of outbreaks of diseases such as dengue fever, Zika fever, and Japanese encephalitis that seriously threaten the life and health of humans and animals. This paper summarizes the epidemiological characteristics of common mosquito-borne viral diseases, and it reviews the advantages, disadvantages, and applicability of detection of mosquito-borne viral pathogens.

　　[ Key words] mosquito-borne viral diseases; detection technique; dengue fever; Zika fever; Japanese encephalitis; review

　　***蚊媒病毒病(mosquito-borne viral diseases)是由蚊媒病毒引起的在蚊虫与脊椎动物之间传播的传染病。已知有300余种蚊虫能够传播蚊媒病毒，这些病毒通过已感染的蚊子传播给脊椎动物，再从脊椎动物传播至吸食其血液的蚊子0。蚊媒病毒病感染人数超过7亿人，每年造成约70万人死亡，在全球范围内持续蔓延并造成严重的公共卫生问题[-3]

　　随着气候变暖及城市化进程加快，蚊媒病毒病在世界范围内广泛流行。由于多数蚊媒病毒病没有有效疫苗或特殊治疗方法，快速准确的检测方法对于流行病学调查、诊断与防控显得尤为重要。为应对蚊媒病毒病潜在的公共卫生威胁，本文以登革热、寨卡热及流行性乙型脑炎为例阐述了蚊媒病毒病流行现状，重点综述了蚊媒病毒的病原学检测方法。

　　1蚊媒病毒病流行现状

　　1.1 登革热 登革热由登革病毒(Dengue virus，DENV)引起.通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。DENV是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科、黄病毒属。人感染DENV后出现头痛、全身肌肉痛、骨关节痛、皮疹和持久高热等症状。

　　自1978年在广东出现首例确诊病例后，登革热在我国东南部的一些沿海省份和云南等地经常发生。2000-2019年，我国登革热发病率呈缓慢上升的趋势，其中2017-2020年登革热报告病例分别为5 893例、5 136例、22 188例、802例[-5]。以2019年为例，云南发病率最高(13.40个病例/10万人口)，其次是广东(5.33个病例/10万人口)、重庆(4.55个病例/10万人口)和福建(4.10个病例/10万人口)[1]，登革热主要发生在每年的夏秋季节，9月和10月达到发病高峰。在30-45岁的人群中，登革热的发病率最高]。近些年我国输入病例逐年增长，特别是东南沿海省份数量多、来源广，但在西南地区较为局限，几乎只来源自东南亚国家[，有学者对杭州西湖区越冬的白纹伊蚊卵进行检测，结果显示DENV阳性率达到了8.33%[a一方面，这提示DENV可能会存在垂直传播的风险;另一方面，检测结果也表明伊蚊卵已成为DENV抵抗不利条件的潜在生存媒介。为了预测登革热潜在爆发的风险，可以通过对其传播媒介的密度、感染率进行监测。刘小波等0分析了2019年我国23个省(自治区、直辖市)媒介伊蚊监测数据，发现伊蚊密度超过了登革热传播阈值，说明当前登革热爆发风险较高。

　　1.2 寒卡热 寨卡热是由黄病毒科、黄病毒属的寨卡病毒(Zir ka virus，ZIKV)引起的蚊媒病，ZIKV分为亚洲型和非洲型，通过伊蚊传播、母婴传播和性传播，提示ZIKV有人际传播的潜力，这在黄病毒中是特有的[1]，与登革热相比，赛卡热的症状较为温和，其典型症状是发烧(多为中低度发热)、斑丘疹、全身乏力、关节痛和非化脓性结膜炎等。

　　ZIKV于1947年首先在东非乌干达的恒河猴体内成功分离[1]。2013-2014年，法属波利尼西亚爆发了寨卡热疫情，重症病例表现为神经系统疾病和自身免疫疾病，如Guillan-Barre综合征[2]，2015年以来美洲持续出现了由于先天感染ZIKV引起的小头畸形婴儿的病例[3]。最新研究表明，美洲爆发造成的大规模疫情可能是由于ZIKV囊膜蛋白突变继而使得其神经毒力增强与病毒血症加重[1]，自2016年2月我国报道了首例寨卡热病例以来，已经发生了至少29起输入性病例[1]

　　Jia等[6]从委内瑞拉返回的中国人员中检测出ZIKV阳性，并在人员所处的社区中发现了伊蚊或其幼虫。这表明ZKV有可能二次传播，提示需要对进出寨卡热流行国家的人员加大防护宣传和监测力度。ZIKV与DENV都通过伊蚊进行传播，有研究发现ZIKV对伊蚊传播DENV具有可能的促进作用[1]

　　ZIKV不仅通过伊蚊传播，有学者在致倦库蚊和骚扰阿蚊中分离出了ZIKV，分析表明ZIKV分离株与美洲流行的毒株具备相同的分子基础，提示应做好寨卡热流行与蔓延的防控工作[3]。

　　1.3 流行性乙型脑炎 流行性乙型脑炎又称日本乙型脑炎，简称乙脑，是由流行性乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis vir rus，JEV)引起的蚊虫传播的人兽共患病。JEV在亚太地区广泛存在，主要通过库蚊(以三带喙库蚊为主)传播，猪和部分水禽(如白鹭)是其中间宿主。库蚊在潮湿的稻田和猪场较为常见，而我国作为稻田种植和猪肉生产大国，面临着蚊媒病毒病的严重威胁。JEV主要感染15岁以下的儿童，在人体表现为轻度的神经系统疾病，包括惊厥、意识障碍等。乙脑的症状严重程度主要与畜龄有关，仔猪会发展成非化脓性脑炎，成年猪多表现为生殖障碍，如流产和短暂不育。

　　随着乙脑疫苗免疫接种的普及，人群发病率总体呈下降趋势。乙脑的发病率从2000年的0.95个病例/10万人口逐步下降到2019年的0.03个病例/10万人口以下，当前以云南、甘肃和四川的发病率最高[4.1]。乙脑主要发生在每年的6-11月份，

　　7-9月份达到发病高峰。乙脑疫苗纳入常规免疫后，15岁以下高发群体的发病率下降，但是乙脑发病年龄段后移，以50岁以上人群发病最多。这提示在保证适龄儿童高接种率的基础上，针对高发群体开展有针对性的预防接种工作是十分必要的。以乙脑为代表的人兽共患病毒病在家畜间传播较为广泛。人是JEV的终末宿主，猪是JEV的主要传染源与中间宿主，鸡、鸭、牛、马、驴、骡等畜禽是JEV的储存宿主。猪源JEV在我国云南、广西、广东、福建、湖南、四川、河南、辽宁和内蒙古等省份均有发现。研究人员从辽宁地区猪血清样本中分离出JEV，该毒株与疫苗株相比有位点突变，这为疫苗研发提供了参考[21

　　Liu等[2]在云南边境居民区的库蚊和仔猪均发现JEV阳性，并对库蚊和仔猪的毒株序列进行全基因组测序，分析发现两者均存在一定程度的进化变异。这既说明JEV在库蚊及猪之间能够有效传播，也提示当地的JEV疫苗可能无法对人群及猪提供完全保护。

　　2蚊媒病毒病原学检测技术

　　2.1 蚊媒病毒分离培养 样品中分离培养出蚊媒病毒是实验室检测的金标准。蚊媒病毒分离培养分为动物接种、蚊虫接种或敏感细胞接种。动物接种是最原始的病毒分离方法，可以在易感动物体内收获大量毒液，乳鼠脑内接种已成功分离出ZIKV，DENV及JEV，蚊虫接种较为少见，但也分离培养出了ZIKV，DENV，JEV及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus.CHIKV)等。敏感细胞分离病毒较为常用，通过观察敏感细胞病变，以此初步判断样品是否含有蚊媒病毒。细胞分离优势体现在能够同时对样品中的多个蚊媒病毒进行分离，甚至是前人未发现的病毒，还能够长期保存病毒毒株以便后续实验。近年来，研究人员己分离出ZIKV，DENV和JEV，但分离培养操作周期长，如样品病毒含量少，细胞病变往往不明显，需盲传多代。病毒种属也不易判断，还要与核酸检测结合进一步验证，这会延长实验周期。

　　2.2 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR(quantitative reahtime PCR，qPCR)克服了常规PCR易污染和无法定量检测的不足，具有特异性好、灵敏度高、结果可靠、定量准确的优点。例如，基于DENV的qPCR检测方法，其灵敏度是常规PCR的10"倍，而且特异性较好，与JEV，CHIKV无交叉反应[2]，不仅如此，有研究学者建立了检测ZIKV和DENV的多联qPCR方法，该方法能够在症状相似的蚊媒病毒病的流行地区进行鉴别检测[3]。目前，qPCR法在DENV，ZIKV，JEV，CHIKV、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、黄热病毒(Yellow Fever vi-rus，YFV)、裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus，RVFV)等多种蚊媒病毒的病原检测中发挥重要作用。但因该法对实验设备及操作环境的高度要求，使得该法局限于实验室内检测。

　　2.3 多重PCR 多重PCR(multiplex PCR，mPCR)技术是由常规PCR发展而来，将多组特异性引物加至同一PCR体系中，实现一次扩增达到多种病原的检测，在混合感染的鉴别诊断中具有显然易见的优势。在蚊媒病毒检测中，蚊虫样品往往存在多种病毒混合感染，mPCR技术可在有限时间内实现多种病毒快速检测。例如，徐焕洲等[2]使用mPCR技术对蚊子样品实现了JEV，ZIKV，DENV及WNV等5种蚊媒病原的快速检测。mPCR建立的关键之一在于调整已知含量的样品核酸来平衡多引物浓度。为解决此问题，Sint等[2]建立了标准化核酸模板，平衡了多引物均匀扩增并提高了多病原检测的灵敏度。mPCR还需要对前期的多引物设计、反应体系及反应程序进行摸索筛选，该过程不可避免的会耗费大量时间。在实际应用中，mPCR与qPCR技术经常结合使用以建立多重QPCR来检测蚊媒病毒。

　　3展望

　　蚊媒病毒每年感染数百万人，对公共卫生的威胁持续上升。我国蚊媒病毒病正在由南向北扩大，病毒潜在的变异，国外输入态势严峻，且缺乏有效治疗手段，应对蚊媒病毒病在时间和空间内的流行情况及现有流行的和新出现基因型的动态变化情况进一步追踪研究。

　　丰富检测技术的多样性，提高检测技术的检出效率对防控蚊媒病毒病的爆发与传播具有重要意义，因此传统检测技术的优化与新检测技术的研发迫在眉睫。第一，当单一感染或混合感染时，鉴别诊断是当前要面对的难题，检测方法应当考虑到这个重要因素。第二，检测技术在保证高特异性、灵敏度的基础上，还要朝着简便快速准确便携低廉的方向发展。第三，通过研究生物菌群与气候环境因素对蚊虫的生理影响及病原-媒 介-脊椎动物-人之间的相互关系，对于更好地理解蚊媒病毒的病原学特征、进化变异规律以及检测技术的建立、如何科学防控蚊虫提供了新的角度。

　　【参考文献】

　　[1]Yu X，Zhu Y，Xiao X，et al.Progress towards understanding the mosquito-borne virus life cycle[J].Trends Parasitol，2019，35(12)：1009-1017.

　　[2]Yuan L.Huang XY，Liu ZY，et al.A single mutation in the prMprotein of Zika virus contributes to fetal microcephaly[J].Science，2017，358(6365)：933-936.

　　[3]Valderrama A，Diaz Y，Lopezverges S.Interaction of Flavivirus with their mosquito vectors and their impact on the human health in the Americas[J].Biochem Bioph Res Co.2017，492(4)：541-

　　547

　　[4]国家卫生健康委员会.2020中国卫生健康统计年鉴[M].北京：中国协和医科大学出版社，2020.

　　[5]国家卫生健康委员会.2020年1-11月全国法定传染病疫情概况

　　[EB/OL].

　　[6]Zhang H，Mehmood K，Chang YF，et al.Increase in cases of dengue in China，2004-2016：A retrospective observational study[J].Travel Med Infect Dis，2020(37)：101674.

　　[7]赵睁，李昱，牟笛，等.2016-2018年中国重点省份境外输入性登革热病例的时空分析[J].中华流行病学杂志，2020，41(11)：1808-1812.

　　[8]沈利明，张丛笑，孔庆鑫，等.2018年杭州市西湖区白蚊伊蚊越冬卵携带登革热病毒情况调查[J].中国卫生检验杂志，2020，30(9);1121-1123.

　　[9]刘小波，吴海霞，郭玉红，等.2019年全国媒介伊蚊监测报告[J].中国媒介生物学及控制杂志，2020，31(4)：401-406.

　　[10]Blohm GM，Lednicky JA，Marquez M，et al.Evidence for mot herto-child transmission of zika virus through breast milk[J].Clin Infect Dis，2018，66(7)：1120-1121.

　　[11]Dick GW，Kitchen SF，Haddow AJ.Zika virus.I.Isolations and ser rological specificity[J].Trans R Soc Trop Med Hyg，1952，46(5)：509-520.

　　[12]Cao-lormeau VM.Blake A.Mons S.et al.Guillair-barre syndrome outbreak associated with Zika virus infection in FrenchPolynesia:a case-control study[J].Lancet，2016，387(10027)：1531-1539.

　　[13]Victora CG，Schuler-faccini L，Matijasevich A，et al.Microcephaly in Brazil;how to interpret reported numbers[J].Lancet，2016，387(10019)：621-624.

　　[14]Shan C，Xia H，Haller SL，et al.A Zika virus envelope mutation preceding the 2015 epidemic enhances virulence and fitness for transmission[J].Proc Natl Acad Sci USA.2020，117(33)：20190-

　　20197.

　　[15] Liu RF.He ZI.Mei P，et al.Risk assessment and genomic characterization of Zika virus in China and its surrounding areas[J].Chin Med J(Engl)，2019，132(14)：1645-1653.

　　[16]Jia H，Zhang M，Chen M，et al.Zika virus infection in travelers returning from countries with local transmission，Guangdong，China，2016[J].Travel Med Infect Dis，2018(21)：56-61.

　　[17]Borchering RK，Huang AT，Mier YT，et al.Impacts of Zika emergence in Latin America on endemic dengue transmission[J]Nat Commun，2019，10(1)：5730.

　　[18]付士红，宋颂，李晓龙，等，从致倦库蚊和骚扰阿蚊标本中分离寨卡病毒的比较研究[J].病毒，2019，35(3)：385-395.

　　[19]国家卫生健康委员会.2019年全国法定传染病疫情概况(2020-04-20)[EB/OL].

　　[20]王纯玉·辽宁地区猪源乙型脑炎病毒血清学调查及主要基因遗传变异分析[D].沈阳农业大学，2019.

　　[21]Liu H，Lu HJ，Liu Z]，et al.Japanese Encephalitis virus in mosquitoes and swine in Yunnan Province.China，2009-2010[J].Vector-Borne Zoonot，2013，13(1)：41-49.

　　[22]汪伟，于宁，刘字梦，等，登革病毒SYBR Green I reaktime PCR方法的建立及应用[J].中国兽医科学，2020，50(11)：1353-1359.

　　[23]Santiago GA，Vazquez J，Courtney S，et al.Performance of the Trioplex reaktime RT-PCR assay for detection of Zika，dengue，and chikungunya viruses[J].Nat Commun，2018，9(1)：1391.

　　[24]徐焕洲，平茵巾，季汝武，等，应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法[J].中国国境卫生检疫杂志，2012，35(2)：73-77.

　　[25]Sint D，Raso L，Traugott M.Advances in multiplex PCR：balancing primer efficiencies and improving detection success[J].Methods Ecol Evol，2012.3(5);898-905.