药用植物组织培养生产次生代谢产物的研究进展

　　摘要：次生代谢产物是药用植物的重要有效成分，但由于野生资源日益减少和栽培品种品质退化，给临床使用和质量控制带来许多困扰，利用组织培养技术生产有效成分，能缓解药用植物资源压力。本文总结了在植物组织培养过程中，外植体的选择、培养条件、培养方法等因素对次生代谢产物积累的影响，并简述了应用诱导子、添加前体物、添加抑制剂和应用基因工程技术四种促进次生代谢产物积累的方法，旨在为利用组织培养技术生产次生代谢产物提供理论参考，为药用植物资源的开发和利用提供科学指导。

　　关键词：药用植物;组织培养;次生代谢产物

　　引 言

　　随着经济的发展、人们对健康需求的提高以及人口进一步老龄化，中药资源的需求量不断提高。目前药用植物主要以人工栽培方式进行生产，相比于农作物，大多数药材的生产周期较长，有限的土地资源也限制了药材种植面积的扩大。传统的栽培方式难以满足中药资源不断增长的需求，同时中药资源需求的不断提高给野生中药资源的保护带来了极大的压力，部分野生中药资源因遭受滥采滥伐而濒临灭绝。采用药用植物组织培养的生产方式，可在有限时间与空间内生产药用植物次生代谢产物，有效解决中药资源的供需矛盾，实现中药资源的有效保护与合理利用。本文综述了药用植物组织培养生产次生代谢产物的研究进展，为通过组织培养技术生产次生代谢产物提供科学指导。

　　1 利用组织培养生产药用

　　植物次生代谢产物的优点组织培养技术是在人为创造的无菌条件下，将活的离体器官(如根、茎、叶、茎段、原生质体)、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中不断培养，以获得细胞、组织或个体的技术[1]。植物代谢过程中产生的各种次生代谢物，在传统医药和食品领域起着重要作用，主要用于医药、食品添加剂和工业产品的生产。传统的栽培方法是通过种子繁殖和扦插等方式获得优良的药用植物品种，该方法耗时长，成 本 高 ，通 常 次 生 代 谢 产 物 含 量 低 ，难 以 大 量 生产[2]。

　　而植物组织、细胞和器官培养技术可在离体培养的微环境中控制植物成分的生长和生产。这个过程可以通过调节各种生长参数和因素来实现，从而使生产最优化，不受地理或季节变化的影响，降低了生产成本。据统计，近 1 000 种药用植物的离体培养技术获得了成功，提供了 600 多种次生代谢产物，其中有些药用植物次生代谢产物含量大于或等于原植物的含量，并且人参皂苷、紫杉醇、青蒿素等的离体培养生产已经达到了工业化水平[3]。目前，为了大量地生产次级代谢产物，细胞、不定根、毛状根已经成功地应用于大规模培养。例如 ，人参(Panaxginseng)不定根培养已经达到 30 000 L，金丝桃(Hy⁃pericum aviculariifolium)不定根已经达到 500 L，紫锥 菊(Echinacea purpurea)不 定 根 已 经 达 到 1 000L[4]。

　　韩国 CBN 生物科技公司，每年生产 40~45 吨人参不定根，这是一个利用植物组织培养生产药品、食品和化妆品的成功范例[5]。中国普瑞康生物技术有限公司通过植物细胞技术已经筛选出顶级的天山雪莲(Saussurea involucrata)培养物，实现雪莲培养物的工业化生产，年产量达 5 000 公斤。运用植物组织培养技术规模化合成中药重要活性物质，解决天然中药材来源与提高药用成分含量，属于生物医药中的中药现代化领域，其产品不仅可广泛用于医药、食品、化妆品、护理品，还有助于解决中药资源的可持续标准化供应问题;带动相关制药工业和制药装备工业的发展;有利于维护生态平衡，保护自然环境;避免人工种植中药材的物种退化;同时符合国家战略规划，有助于实现中药材产业现代化。

　　2 影响药用植物组织培养生产次生代谢产物的因素

　　2. 1 外植体的选择

　　能够发生次生代谢的细胞株往往来自适当生理状态下的外植体[6]。通常，不同植物或器官所含有的次生代谢产物的含量和种类不同。一般由次生代谢活动旺盛的植物或器官诱导出的愈伤组织中的次生代谢产物含量较高[7]。对从野生葡萄(Vitis vinif⁃era)不同器官培养获得的愈伤组织细胞培养物进行研究，结果发现茎诱导的愈伤组织中苯丙氨酸解氨酶和苯乙烯合成酶基因表达量比叶和叶柄诱导的愈伤组织中的要高[8]。有研究学者对姜黄(Curcumalonga)进行研究，分别用叶鞘、叶片、叶基部、顶端芽和侧芽诱导培养愈伤组织，6 次继代培养后，以侧芽为外植体的愈伤组织中姜黄素和总酚的含量明显高于 其 他 愈 伤 组 织[9]。

　　用 荷 包 牡 丹(Lamprocapnosspectabilis)的叶片、叶柄和节间外植体进行愈伤组织诱导，发现外植体类型对愈伤组织中花青素和多酚有显著影响，叶柄愈伤组织和节间愈伤组织的花青素含量和多酚含量高于全叶愈伤组织的花青素含量和多酚含量[10]。有研究表明，与由花诱导的愈伤组织相比，由蔷薇(Rosa gallica)叶片和茎诱导的愈伤组织的花青素和叶绿素产量最高[11]。有研究表明外植体类型会影响凤仙花(Impatiens balsamina)根培养物中的萘醌产量，由叶外植体培养产生的萘醌总量高于由根外植体培养产生的萘醌总量[12]。因此，利用植物组织培养技术生产次生代谢物时，选择生长快速且具有较高次生代谢物合成能力的外植体非常重要。

　　2. 2 培养基的成分

　　2. 2. 1 碳源糖在培养基中的类型和浓度是影响次生代谢产物生物合成的重要因素。植物组织培养通常使用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖等作为能量和碳源进行异养生长。相比于果糖和葡萄糖，蔗糖被发现是诱导马来沉香(Aquilaria malaccensis)愈伤组织产生最高生物量的最有效碳源;浓度为 15 g/L 的蔗糖显著诱导愈伤组织增殖，产生的生物量高于葡萄糖的 1. 2倍 ，高 于 果 糖 的 2 倍[13]。 研 究 蔗 糖 浓 度 对 三 七(Panax notoginseng)不定根培养过程中三种人参皂苷(Rg1、Re 和 Rb1)积累的影响，结果发现在 30 g/L蔗糖处理下，三种人参皂苷含量最高[14]。苦艾(Ar⁃temisia absinthium)细胞悬浮培养中，在最大生物量和次生代谢产物积累方面，双糖(蔗糖和麦芽糖)处理优于单糖(果糖和葡萄糖)处理;在蔗糖和麦芽糖处理下，生物量最大，总酚和总黄酮生物合成含量最高[15]。有研究发现，当蔗糖浓度高于 5% 时，可抑制刺参(Oplopanax elatus Nakai)不定根中酚类化合物的积累，这表明高浓度蔗糖引起的高渗透胁迫对刺参体内总酚的积累产生了不利影响[16]。

　　用不同浓度的 蔗 糖 对 龙 葵(Solanum nigrum)愈 伤 组 织 进 行 培养，发现随着培养基中蔗糖含量的增加，愈伤组织中龙葵碱含量显著增加[17]。用不同浓度的蔗糖对夏枯草(Prunella vulgaris)悬浮细胞分别进行培养，结果发现在 20~25 g/L 蔗糖处理下，生物量、酚类物质、黄酮类物质、蛋白质含量和抗氧化活性均达到最大值[18]。用不同水平的果糖、半乳糖、葡萄糖和蔗糖为碳源培养山莨菪(Anisodus acutangulus)毛状根时，发现用蔗糖含量为 3% 的培养基培养的毛状根生物碱含量最高[19]。从上述可知，植物的生长和次生代谢物合成与碳源有关，要促进次生代谢产物积累，碳源的组成和浓度都是要考虑的重要影响因素。

　　2. 2. 2 氮源氮源是植物正常生长的必要条件，不同 NH4+/NO3- 比值的氮源对植物的生长和代谢有显著的影响，且单独以硝酸盐或铵盐为氮源，都不利于植物的生长和代谢。Irshad 等[20]分析了 MS 培养基中不同浓度的总氮对野生秋葵(Abelmoschus esculentus)愈伤组织中花青素的影响，发现在中氮水平培养基中，花青素积累增强，而高氮水平和低氮水平培养基中，花青素产量下降。在金铁锁(Psammosilene tunicoi⁃des)毛状根悬浮培养中，当培养基中 NH4+ 与 NO3-的浓度比为 1∶2 时，毛状根生物量和总皂苷的收获量都达到最高值[21]。研究发现，硝态氮和铵态氮比例为 5∶1 时，甘草(Glycyrrhiza uralensis)细胞获最大生 物 量 ，以 铵 态 氮 为 氮 源 ，黄 酮 类 物 质 积 累 量 最高[22]。

　　为优化雷公藤(Tripterygium wilfordii)毛状根的生物量和生产雷公藤碱乙和雷公藤次碱的培养基，研究表明，10∶50(NH4+/NO3-)处理的毛状根生物量最大，雷公藤碱乙和雷公藤次碱产量最大;虽然在 50∶10(NH4+/NO3-)浓度处理下，雷公藤碱乙和雷公藤次碱的含量最高，但是 50∶10(NH4+/NO3-)的生物量显著低于 10∶50(NH4+/NO3-)处理的生物量，导致雷公藤碱乙和雷公藤次碱的产量显著低于10∶50(NH4+/NO3-)处理的;从而得出 10∶50(NH4+/NO3-)对 雷 公 藤 毛 状 根 生 长 和 生 物 碱 积 累 最 适宜[23]。

　　研究氮对甜叶菊(Stevia rebaudiana)次生代谢产物的影响，结果表明，高水平的氮导致莱鲍迪糖苷 A 的含量减少，在 2. 5~3. 5 倍氮培养基上生长的植株的莱鲍迪苷 A 水平显著降低，这与培养基中的氮供应呈负相关[24];对照组中莱鲍迪甙 A 和甜菊糖苷含量均最高;然而，甜菊糖醇含量被发现与生长培养基中氮水平的增加呈正相关。从这些研究可知，选择合适的氮源有利于次生代谢产物的积累。

　　2. 2. 3 磷源磷源是一种重要的营养物质，参与代谢产物的形成、能量代谢和生物合成。将甘草不定根接种于添加不同浓度磷酸盐的 1/2 MS 培养基中培养[25]，结果 表 明 ，在 1. 25 mmol/L 磷 酸 盐 处 理 下 ，多 糖(15. 66 mg/g)含量达到最大值;0. 625 mmol/L 磷酸处理的黄酮类化合物(7. 54 mg/g)和甘草酸(0. 57mg/g)积累量最高;甘草次酸(0. 32 mg/g)积累的最适 磷 酸 盐 浓 度 为 0. 312 5 mmol/L。 在 长 春 花(Catharanthus roseus)细胞悬浮培养中，添加不同水平的磷酸氢二铵和磷酸二氢铵，总氮(NH4++NO3-)和磷酸盐的增加会促进生物碱生物合成的增强[26]。

　　在太子参(Pseudostellaria heterophylla)不定根培养中，低磷酸盐浓度有利于生物量的产生，而高磷酸盐浓度则能显著提高太子参不定根培养中多糖的含量[27]。在培养西洋参(Panax quinquefolius)毛状根的 B⁃5 培养基中添加 0. 83 mmol/L 磷酸盐，6 种人参皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re 和 Rg1)的总含量达到最大 值 ，与 对 照 组 相 比 ，人 参 皂 苷 的 含 量 增 加 了20%[28]。在人参的不定根培养中发现，当磷酸盐浓度为 0. 625 mmol/L 时，根生长率达到峰值，然而当磷酸盐浓度为 1. 25 mmol/L 时，人参皂苷含量达到最大值[29]。这些结果说明，磷源对次生代谢产物的积累也起着重要的作用，不同植物的次生代谢产物积累所需要的磷浓度不同。

　　2. 3 培养条件

　　2. 3. 1 光照光是直接影响植物发育过程和次生代谢产物生物合成的关键诱导子之一。不同的光照强度、光质、光周期会影响药用植物次生代谢产物的积累。珐菲 亚(Pfaffia glomerata)在 三 种 不 同 比 例 的 红 色(R)和蓝色(B)灯光下体外培养：(i)1R∶1B，(ii)1R∶3B，(iii)3R∶1B;红光和蓝光配比相同(1R∶1B)可增加生物量积累、花青素含量和 20 ⁃羟基蜕皮激素产量(提 高 30%~40%)[30]。 分 别 在 100% 红 、100%蓝 、100% 绿 、RGB(40% 红∶40% 绿∶20% 蓝)和100% 白(对照)光照条件下培养红景天(Rhodiolaimbricata)愈伤组织，结果表明，与其他光照条件相比，蓝光处理愈伤组织培养的红景天苷、总酚和总黄酮积累量最大[31]。

　　研究不同光谱光对罗勒(Oci⁃mum basilicum)愈伤组织中苯丙烷代谢产物生物合成的影响，与对照组相比，蓝光处理下的生物量积累 、总 酚 含 量 、总 黄 酮 含 量 以 及 抗 氧 化 剂 DPPH、FRAP 和 ABTS 的活性最大[32]。分别在光照和黑暗条件下进行紫草(Arnebia euchroma)细胞的悬浮培养，观察光照对萘醌色素合成的影响，发现在光照条件下，直到培养第 4 天，萘醌色素含量都有所增加，但随着培养时间的延长，在光照条件下萘醌色素含量降低，而在黑暗条件下萘醌色素含量继续增加[33]。 用 不 同 的 光 培 养 催 眠 睡 茄(Withania som ⁃nifera)愈伤组织，发现紫光条件有利于愈伤组织中酚类化合物和黄酮类化合物的合成;红光处理下愈伤组织中生物量积累效果最好，以及绿原酸和醉茄素 A 含量显著增加[34]。这些研究表明，不同的药用植物有各自的最佳光照条件，适当调整光照质量和光照量可以提高次生代谢产物的产量。

　　2. 3. 2 温度药用植物离体培养温度一般为 20~28 ℃，通常控制在 25 ℃左右。温度不仅影响植物生长，还控制产物合成途径相关酶的活性，从而影响次生代谢产物的积累。在三分三(Anisodus acutangulus)毛状根培养中，当温度为 25 ℃时毛状根的生物量和莨菪碱含量最高，低于 25 ℃和超过 30 ℃时毛状根生物量和莨菪碱含量显著下降[35]。山羊豆(Galega officina⁃lis)愈伤组织培养时，用四种不同温度(4 ℃、22 ℃、35 ℃和 45 ℃)处理后，发现 4 ℃处理下木质素、染料木素、对香豆酸、柚皮苷、芹菜素、反式阿魏酸、水杨酸和芦丁含量最高[36]。

　　用不同温度培养人参不定根，结果表明，人参总皂苷在 25 ℃培养时含量最高;此外，研究还表明，低温刺激可促进人参皂苷的积累，10 ℃环境下处理 7 d，然后转移到 25 ℃处理 28 d时，人参总皂苷含量较 25 ℃处理增加了 2. 53 倍[37]。在翅萼石斛(Dendrobium cariniferum)体外培养中，当培养温度为(23±2)℃时，生物量积累最高，然而幼苗的生长消耗了营养，导致生物活性化合物的积累很少;当培养温度为(25±2)℃时，虽然幼苗生长较慢，但此时多糖和生物碱积累量较其他培养温度最 高[38]。 研 究 不 同 温 度 对 水 飞 蓟(Silybum maria⁃num)毛状根培养物生物量和水飞蓟素的影响[39]，结果 表 明 ，25 ℃/25 ℃ 培 养 下 毛 状 根 水 飞 蓟 素 产 量(0. 18 mg/g DW)高 于 15 ℃/20 ℃和 30 ℃/25 ℃培养 下 水 飞 蓟 素 产 量(分 别 为 0. 13 和 0. 12 mg/gDW)。不同植物的最适温度不同，因此选择适宜的温度对药用植物次生代谢产物的合成十分重要。

　　2. 3. 3 pH 值培养基的 pH 值对植物生长和次生代谢产物积累有显著影响。植物生长直接受培养基营养成分的影响，但营养的吸收主要受培养基 pH 的影响。pH的变化会影响培养基成分的状态，从而影响次生代谢产物的积累。不同植物的高效生长、发育和次生代 谢 产 物 的 产 生 都 需 要 特 定 的 pH 值 。 对 鬼 臼(Podophyllum hexandrum Royle)不 定 根 培 养 进 行了不同 pH 处理的试验[40]，结果表明，当初始培养基pH 为 6 时，鬼臼不定根培养过程中生物量和鬼臼毒素积累量最高。培养液中不同 pH 对铁皮石斛(Den⁃drobium candidum)原球茎生物量及有效物质含量有影响，当培养液 pH 为 5. 8 时，原球茎生长最好，且多糖和生物碱生产量达到最高[41]。

　　在睡茄(Witha⁃nia somnifera)细胞培养中，高 pH 和低 pH 培养基都不能刺激生物量和睡茄内酯 A 的产生[42]，但在芽培养中，初始 pH 为 4. 5 的培养基最适合生物量和苦艾素 A 的产生[43]。研究发现在甜叶菊(Stevia rebaudi⁃ana)不定根培养中，较低的 pH 水平(pH=5. 1)促进甜菊糖苷和莱鲍迪苷 A 的合成，但多酚类物质的产量减少;当 pH 为 5. 8 时，杜克苷含量较高[44]。研究pH 对灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoids)细胞悬浮培养物产量和绿原酸的影响[45]，发现培养基 pH 为5. 5 和 6. 0 时生物量最高，分别为 6. 52 g/L 和 6. 76g/L，此时绿原酸含量最高。因此，调整 pH 值是提高次生代谢产物含量的一种有效方法。

　　2. 5 培养方法

　　2. 5. 1 两阶段培养

　　两阶段培养法是指第一步主要使用适合细胞生长的培养基即生长培养基，第二步使用适合次级代谢产物积累的培养基即生产培养基。由于细胞生长和次生代谢物产生对培养基和培养条件的要求不同，一般采用两阶段培养法来提高生物量和次生代谢产物。在研究长春花(Catharanthus roseus)摇瓶悬浮液生产吲哚生物碱时，使用两种方式进行培养，一种方式直接放置于生长培养基中培养，另外一种方式采用两阶段培养技术进行培养，两种培养体系可产生高达 20 g/L DW 的生物量;但两阶段培养技术产生的细胞活性更高，吲哚生物碱产量比另外一种 培 养 方 式 高 10 倍 ，且 产 物 显 著 释 放 到 培 养 基中[51]。

　　研究发现明党参(Changium smyrnioides)悬浮细胞采用两阶段培养后的第 20 d，生物量的积累达到最大值，比只使用 MS 培养基的细胞数目提高了 12. 6%，第 24 d 总 香 豆 素 积 累 量 达 到 最 大 值0. 288 2 mg/L，比 只 使 用 White 培 养 基 的 提 高 了60. 7%，细 胞 中 佛 手 酚 、佛 手 柑 内 酯 含 量 达 到 了1. 79%、0. 36%，比 一 步 法 提 高 了 1. 75 倍 和2. 86%[52] 。 采 用 两 阶 段 培 养 体 系 进 行 巴 戟 天(Morinda coreia)不定根培养，首先在添加 1. 0 mg/L IBA 的液体培养基中增殖巴戟天不定根，然后把这些不定根转到两阶段培养体系，在不含 IBA 的液体培养基中培养，结果发现，蒽醌类化合物的产量是体内培养的 4. 09 倍[53]。两阶段培养法使细胞生长和代谢均能在适合的条件下进行，较好地解决了细胞生物量增殖与次生代谢产物积累之间的矛盾，是促进次生代谢产物合成的一种较好的方法。

　　2. 5. 2 两相培养

　　两相培养技术是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相;细胞在水相中生长，合成的次生代谢物质分泌出来后转移至有机相中。由于植物次生代谢产物在培养的植物细胞中合成和储存的位置不同，在细胞培养中的次生代谢产物含量低可能是由于反馈抑制、在培养基中合成产物被酶或非酶降解或可能产生的代谢物具有挥发性。因此，在液体培养基中添加液体或第二固相的人工堆积生产位点可以提高净生产率[54]。

　　两相共培养利用分配系统将培养基中的分泌产物重新分配到第二个非极性阶段，有效避免反馈抑制效应，在细胞、组织或器官培养生产次生代谢产物方面具有重要应用价值。采用两相培养法进行夏雪片莲(Leucojum aestivum)芽培养，胞内加兰他敏积累量是对照的 1. 7 倍，胞外加兰他敏积累量是对照的 1. 9 倍[55]。采用固液两相培养技术对紫草(Arnebia euchroma)细胞进行了培养，其中固相为聚氨酯泡沫，实验中加入聚氨酯泡沫后紫草色素的合成及分泌提高了 3 倍多[56]。以雷公藤(Tripterygium wilfordii)不定根为材料，通过两相培养技术，研究有机溶剂邻苯二甲酸二丁酯(DBP)不同浓度及培养时间对雷公藤不定根生长及次生代谢产物含量的影响，结果显示，DBP 浓度为 6%、培养至第 6 d 时，不定根增长量为对照的 1. 06 倍;DBP浓度为 2%、培养至第 8 d 时，内酯醇含量达 74. 96μg/g，为对照组(53. 67 μg/g)的 1. 40 倍[57]。

　　3 调控药用植物组织培养生产次生代谢产物的途径

　　3. 1 诱导子的应用植物

　　次生代谢产物是植物细胞在体内生长过程中对环境干扰的反应而产生的，是对入侵病原菌诱导子的防御反应。因此，越来越多人使用化合物来触发培养的植物细胞、组织或器官的防御反应，以提高体外培养中生物活性化合物的产量。这些诱导子可以是生物或非生物的，可能包括信号分子(如茉莉酸甲酯、水杨酸)、微生物细胞壁提取物(如酵母提取物、壳聚糖)、无机盐、重金属甚至物理制剂(如紫外线辐射)等[59]。这为提高植物体外培养产量提供了另一种途径，并在许多细胞、组织和器官培养系统中取得了成功。在西洋参(Panax quinquefolius)悬浮培养中，使用一种非生物诱导子硝酸钴，使人参皂苷产量比对照增加两倍[60]。

　　研究生物诱导子粉红粘帚霉发酵液、茉莉酸甲酯和冠菌素对桃儿七(Sinopodo⁃phyllum hexandrum)不定根鬼臼毒素积累的影响[61]，结果表明，粉红粘帚霉发酵液、茉莉酸甲酯和冠菌素都能显著地促进不定根鬼臼毒素的积累。在八角莲(Dysosma versipellis)离体培养中使用真菌诱导子，经过 3 周的培养，内生真菌诱导子能提高八角莲离体根中鬼臼毒素的含量[62]。在瓜叶栝楼(Trichosanthescucumerina)细胞悬浮培养中，用 200 µmol/L 的茉莉酸甲酯诱导子处理 6 d 后可以生产更多的泻根醇酸，约为相应的对照组的两倍;而用 1 mg/mL 的壳聚糖诱导子处理 8 d后泻根醇酸水平增加到几乎比对照组高 出 两 倍 的 水 平[63]。 对 蛇 根 草(Ophiorrhiza mun⁃gos)进行悬浮培养时，当用酵母提取物和硝酸银作为诱导剂时，喜树碱的产量分别增加了 13. 3 倍和 8. 7倍[64]。可见使用适宜的诱导子对植物次生代谢产物的合成有一定的促进作用。

　　3. 2 添加前体物

　　提高体外次级代谢产物产量的一个重要障碍是初级底物水平低，这可以通过前体饲喂来解决。外源应用前体物可以提高次生代谢产物的合成，基于这一理念：任何在次生代谢产物生物合成途径中是起始物或中间体的化合物，都有望促进次生代谢产物的合成[65]。研究发现，投喂石蒜科生物碱前体 4'⁃O⁃甲基降孤挺花啶显著提高了水仙(Narcissus tazet⁃ta)鳞茎中加兰他敏和石蒜碱的积累[66]。有研究发现 L⁃酪氨酸会影响菜豆(Phaseolus vulgaris)愈伤组织中 L⁃DOPA 的积累，在所有测试浓度下，L⁃酪氨酸从第 3 天到第 12 天都提高了 L⁃DOPA 的含量;到第 12 天，L ⁃DOPA 浓度达到最大值 200 mg/L，增加了 17. 75 倍;结果表明，L⁃酪氨酸可作为合成 L⁃DO ⁃PA 的天然有效前体[67]。

　　在北美圆柏(Juniperus vir⁃giniana)愈伤组织和悬浮培养中添加前体物苯丙氨酸，愈伤组织在添加 10 mmol/L 苯丙氨酸处理 21 d后，对鬼臼毒素的产量影响最大，鬼臼毒素的含量为0. 15 mg/g DW，比对照高 400% 左右;新衍生的悬浮培养物(第 4 代)在添加 1 mmol/L 苯丙氨酸后，鬼臼毒素在 14 d 后含量最高(0. 48 mg/g DW)，这比对照高出 243%[68]。在积雪草(Centella asiatica)毛状根培养中，分别使用不同浓度的角鲨烯和丙酮酸前体物，发现角鲨烯和丙酮酸前体物能促进积雪草毛状根三萜类化合物的积累[69]。为提高肉桂三萜的含量，将角鲨烯、胆固醇和甾体酚等外源性甾醇饲喂肉桂(Cinnamomum cassia)的培养物，发现高剂量的甾体酚饲喂可促进三萜的产量增加[70]。这些研究表明，添加前体物对次生代谢产物的合成具有积极的促进作用。

　　3. 3 添加抑制剂添加代谢抑制剂

　　可抑制旁路代谢和切断其他非目标代谢物的合成途径，改变细胞中代谢物的方向，从而促进目标化合物的合成。在红豆杉(Taxuscuspidata)悬浮细胞培养中，分别添加洛伐它汀(甲羟戊酸途径抑制剂)和磷甘霉素(非甲羟戊酸途径抑制剂)进行处理，发现两种抑制剂对紫杉醇的积累都有促进作用，而磷甘霉素作用较大[71]。在东北红豆杉(Taxus cuspidata)悬浮细胞培养中，分别添加赤霉素和肉桂酸代谢抑制剂，发现两种代谢抑制剂对紫杉醇的生物合成都有促进作用，随着浓度的增加，紫杉醇单位产量先增加，然后达到最大值，然后略有下降，这是由于抑制了与紫杉醇合成无关的分支途径，所以反应倾向于紫杉醇合成的方向[72]。

　　在海南粗榧(Cephalotaxus mannii)悬浮培养第 15 日，添加30 mg/L 丙氨酸(糖酵解途径中重要的限速酶丙酮酸激酶的抑制剂)时，对海南粗榧三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的积累都有一定的促进作用，产物含量最高，为对照组的 1. 7 倍[73]。在嘉兰(Gloriosa super⁃ba)细胞悬浮培养中，分别添加不同剂量的乙烯抑制剂 AgNO3，AgNO3处理的细胞悬浮培养物在培养 15天和 30 天内，秋水仙碱和硫秋水仙苷生物合成含量均有所提高[74]。可见使用抑制剂是提高次生代谢产物含量的一种有效手段。

　　4 展 望

　　近几十年来，药用植物离体培养技术发展迅速，成为解决珍稀药用植物资源短缺的有效手段。但是很多药用植物组织和细胞的次生代谢产物含量少于原植物，没有达到预期的目的，而且成本较高。展望未来，药用植物次生代谢产物的生产要想实现工业化发展，应从以下几个方面着手：(1)阐明特定生产策略中涉及的信号转导途径，以提高生物量和分子的生物合成;(2)调控生产的控制因素和机制，包括基因操作以提高生产;(3)克隆参与生物合成的基因及其修饰设计目标分子的代谢通量;(4)分析代谢通量和中间体，以了解它们的生物合成途径和调控。随着科学技术的进一步发展，相信在不久的将来，药用植物次生代谢产物的工业化生产体系会变得更加成 熟 ，为人 们 的 健 康 和 治 疗 疾 病 提 供 丰 富 的 原 料资源。

　　参考文献

　　[ 1 ] 陈红 . 植物组织培养技术的现状及发展趋势[J]. 生物化工, 2018, 4(5): 137⁃139.Chen H. Present situation and development trend ofplant tissue culture technology [J]. Biol Chem Eng,2018, 4(5): 137⁃139.

　　[ 2 ] 杜尚广, 盛文涛 . 影响植物组织培养生产次生代谢产物的因素[J]. 园艺与种苗, 2018, 38(11): 30⁃33, 43.Du S G, Sheng W T. Influencing factors of the produc⁃tion of secondary metabolites in plant tissue culture [J].Hortic Seed, 2018, 38(11): 30⁃33, 43.

　　[ 3 ] 李永成, 蒋志国 . 药用植物的细胞悬浮培养技术与应用[J]. 生物技术通讯,2015, 26(2): 271.Li Y C, Jiang Z G. Cell suspension culture of medicinalplants and its application [J]. Lett Biotechnol, 2015, 26(2): 271.

　　[ 4 ] Paek K Y, Murthy H N, Zhong J J. Production of bio⁃mass and bioactive compounds using bioreactor technol⁃ogy [M]. Netherlands: Springer, 2014.

　　作者：范沾涛 1，2，3，韦 范 1，2，乔 柱 1，2，梁 莹 1，2，谢唐贵 1，刘吉华 3 *，韦坤华