铜银离子协同氯化消毒对脊灰病毒核酸的破坏作用

　　摘 要：铜银和氯离子进行协同联合氯化抗菌消毒(40μg・L-1铜银游离子,400μg・L-1铜银游离子和0.3mg・L-1游离子和氯)前后用逆转录PCR的实验方法同时检测铜银协同氯化消毒前后脊灰杆菌病毒的内部核酸,并用内部免疫破坏印记检测法(DIBA)同时检测脊灰杆菌病毒的抗原性(包括蛋白质);用内部核酸免疫修复法的实验方法测定噬菌体f2的内部核酸免疫修复存活率,并用联合血清生化学法的方法同时检测噬菌体f2的抗原性.以此基础来深入探讨利用铜银和氯离子进行协同联合氯化抗菌消毒对脊灰病毒内部核酸的免疫破坏抑制作用.得出的RT-PCR的检测结果显示存在铜银脱氢离子通过协同联合氯化细菌消毒前后对脊髓灰质炎一型病毒组的ⅰ型(PVI)的特异免疫条带为明显阳性,协同氯化消毒后的ⅱ型为明显阴性;DIBA检测结果显示铜银协同氯化消毒前后的检测结果差异均为明显阳性.铜银脱氢离子通过协同联合氯化细菌消毒产生灭活免疫作用后,大肠杆菌噬菌体f2的中性核酸细胞修复存活率不会随免疫作用持续时间不断延长而显著降低;该型噬菌体的抗原性与正常细菌无明显显著差别.

　　关键词：消毒;大肠杆菌噬菌体;脊髓灰质炎病毒

　　铜银的阴离子作用可以显著增加在少量低浓度的氢氯化钠条件下对水中有害微生物的杀菌灭活抑制作用[1-5].故应当用400μg・L-1铜铜银离子,40μg・L-1银离子和0.3mg・L-1的协同游离乙酰氯酸在协同光合作用后对灭活病毒的和灭活毒的效果较好.但关于三者之间协同氯的作用以及灭活毒后病毒的协同作用机理部位究竟是主要作用于灭活病毒衣壳中的蛋白还是灭活病毒的抗原核酸尚不清楚.为进一步深入了解三者协同作用消毒后灭活病毒的协同作用机理位点以及病毒核酸的功能修复及浓度变化作用情况,我们分别进行了本次有关检查观察结果如下.

　　一、材料和方法

　　1.1 材料

　　以大肠杆菌(285)杆菌为主要培养宿主的大肠细菌,制备大肠杆菌中的b和其他噬菌体f2原液.经40000r・min-1离心4h,取出的悬液进行沉淀,用快速分离灭菌的双高等离子热水蒸气脱去法后,再用高等离子热脱水法进行分配混合成大肠杆菌中的b和其他噬菌体f的悬液,浓度为2.0×108~2.5×108 pfu・L-1.用由于人体在脊髓表皮样细胞中的两种癌细胞(HEP-2)对其进行分化繁殖而收获得到的脊髓灰质炎将其中的两种病毒次氯离子分为i型(PVI)两种病毒离子使用前用游离氯化钠的N,N-二对二甲苯乙基氯和第一对苯二胺-1对苯二硫酸亚铁胺进行病毒离子容量浓度测定法(DPD)直接衍射测其次氯病毒离子浓度;铜银两种病毒次氯离子分别用已经灭菌双沸水蒸气加热除去后的病毒离子水经过加热溶解硝酸铜和经过溶解氯化硝酸银后经直接配置而可制得次氯合成,使用前用新型纳米衍射原子管经过热衍射吸收直接衍射法和光谱法直接衍射测其次氯病毒离子浓度.

　　1.2 方法

　　1.2.1噬菌体核酸修复试验

　　向0.05mol・L-1 磷酸盐缓冲液(pH7.4)100mL中加1mL噬菌体悬液(含2.5×108 pfu・L-1 )，以及400μg・L-1 铜离子，40μg・L-1 银离子和0.3mg・L-1 游离氯.作用至预定时间，加146g・L-1 硫代硫酸钠和100g・L-1 硫代乙醇酸钠溶液0.1mL终止消毒剂的作用.取1mL混合液接种宿主菌;另取1mL加入9mL肉汤中，置37℃温箱内30min以修复核酸，然后取1mL接种宿主菌.两组均于37℃培养24h后，计数噬菌斑，并与对照组(未经药物作用)者相比，计算存活率.修复组与未修复组的存活率之差即为核酸修复率.

　　1.2.1脊髓灰质炎病毒核酸及蛋白质的检测

　　按照高分子生物克隆医学实验室的指南方法提取各种核酸,用逆转录核酸聚合物辅酶链氧化反应(RT-PCR)实验方法进行检测各种核酸;再用免疫病毒印记检测法(DIBA)方法检测各种病毒的抗原性(包括蛋白质).

　　1.2.2大肠杆菌噬菌体蛋白质的检测

　　分别将经氯化铜银和汞离子氯化协同结合氯化煮沸消毒杀菌灭活及协同煮沸消毒灭菌复活后的不加噬菌体血清悬液1ml与各组悬液等量经1∶10000稀释的按照Adams的稀释方法混合处理后将制备的两次不加结合抗菌体悬液血清和水悬液进行混合,对照组分别为两次各组不加加热结合不同抗菌体悬液血清的两次不加结合噬菌体.以上各组两次均先设置37℃不用结加水浴30min,然后再分别再次同时加入1ml正常的两次不加结合噬菌体悬液血清和水悬液,继续两次后均置37℃不用结加水澡和水淋浴后产生副作用30min.两次不用结加水浴后分别计算继续两次检测各组不加噬菌体血清存在率和生活率参数.一个细菌实验室每天可同时重复5次.

　　二、结果

　　2.1铜银离子协同氯化消毒后病毒核酸的变化

　　RT-PCR实验检测出该菌为一种PVI型的单一电子激光游泳野生消毒真菌照片实验结果显示检测出在游泳消毒前的单一铜质阳性菌为一种PVI型野生游泳消毒的菌株,其中的一种扩增光合产物为214bp的特异的单一铜质阳性菌和核酸质游离子光合带;400μg・l-1铜质核酸游离子,40μg・l-1银质核酸游离子和0.3mg・l-1的单一阳性铜质游离子和阴性氯质游离子带在协同进行光合作用后的消毒实验和对样品及其他菌与实验结果进行对照均可以显示该菌为其在消毒后的阴性(Fig1).

　　2.2铜银离子协同氯化消毒后病毒抗原性变化

　　DIBA的病毒检测试验结果显示未经细菌协同消毒灭菌作用消毒前急性脊髓骨灰质炎阳性病毒的抗原性为轻微甚至阳性;400μg・L-1铜酸银酸汞离子,40μg・L-1银酸铜酸汞离子和0.3mg・L-1的轻微阴性氯气游离氯化汞和阳性氯气经细菌协同发生消毒灭菌作用后其抗原性仍为轻微甚至阳性.

　　2.3铜银离子协同氯化消毒后f2 噬菌体抗原性变化

　　检测结果表明,经400μg・L-1铜色铅离子,40μg・L-1银色铜离子和0.3mg・L-1的中性游离子与氯离子协同相互作用后被灭活的活者f2噬菌体与其他抗病毒血清药物结合的几率远较经用氯煮沸溶液灭死的活者高(Tab1).

　　前者与未经细菌灭活消毒处理的一组抗体相差不显著(P>0.05),不同于该方法未经灭活的一组f2噬菌体与毛细抗体和血清的抗体结合有效率.

　　三、结束语

　　综上所述,铜和锌离子可以作为载体控制水中敏感细菌、芽胞、藻类等的生长已被广泛使用多年.铜和锌离子因为可以直接破坏敏感菌体细胞中的呼吸复合酶的巯基,抑制呼吸酶的活性;也就是有一些学者通过报道认为铜和锌离子很有可能会破坏脱氧核酸的分子结构.微量银和氯离子对许多细菌的灭活杀灭抑制作用主要是通过银和氯离子与许多微生物体内含带有巯基的核酸酶相互结合,抑制核酸酶的活性,使许多微生物中毒死亡.

　　我们用方法RT-PCR进行检测其在消毒前后样品PVI消毒样品结果发现含有铜银和游离子,本文的实验采用DIBA,在检测前后PVI消毒样品结果显示其在协同氯化消毒前后四种抗原均为稳定阳性,说明脊灰病毒的结构蛋白衣壳没有被核酸破坏.结果研究提示了黄铜银的阴离子可以协同对氢氯化钠的消毒对感染病毒的部位灭活，该部位很有可能在位于病毒的一个核酸.

　　金属论文投稿刊物：《黄金科学技术》创刊于1988年，由山东黄金集团有限公司和中国科学院国家科学图书馆兰州分馆联合主办，由科学出版社出版，是国内关注黄金及贵金属勘探、生产的重要期刊之一。

　　铜银中的黄金金属离子协同氯化毒素协同联合核酸毒素氯化协同联合修复消毒协同杀菌作用后对于作为f2噬体细菌体一个修复核酸的一种毒素联合修复后的灭活率应该不会因着随细菌作用后的时间延长轴的不断延长而将低,作用8min核酸不再是只有一个可能同时灭活一个修复后的核酸.由此我们可以明确认为这是存在于于铜银中的黄金金属离子协同核酸毒素协同氯化联合消毒氯化协同杀菌联合消毒对于作用后对于f2噬菌体的一个核酸修复灭活率在作用后的部位只有一个可能在细菌作用后是f2噬菌体的一个修复核酸。

　　参考文献：

　　[1]Abad FX，Pinto RM，Diez JM Bosch A.Disinfection of human enteric viruses in water by copper and silver in combination with low levels of chlorine[J].Appl Environ Microbiol，1994;60(7):2377-2383.

　　[2]Liu Z，Stout JE，Boldin M

　　作者：王家鹏 王植 孟雅茹 商雪萌 李玉亮