气象因子对赤霞珠果实GLVs香气的影响

　　摘要：【目的】为探究影响葡萄中绿叶挥发物(Greenleafvolatiles，GLVs)形成的关键气象因子。【方法】本实验于2018年以国内七个产地的成熟期赤霞珠果实为试材，分析了各产地的气象因子和果实的香气特征，并且通过相关性分析筛选了影响果实GLVs香气合成的关键气象因子。【结果】张掖，高台产地7—9月份的日照时数和温差显著高于其他产地，降雨量均低于其他产地;胶东半岛产地(蓬莱，莱西)7—9月份的日照时数最短，平均温度最高，温差最小;银川和怀来产地的气象条件更为相似，7—9月份日照时数劣于高台产地但优于胶东半岛，平均温度高于五家渠、高台、张掖但低于蓬莱、莱西产地。七个产地的葡萄可根据其香气特征分为三簇，一簇是张掖，高台和莱西;一簇是银川和怀来;一簇是五家渠和蓬莱。其中蓬莱产地的赤霞珠果实C6/C9醛类香气含量较高，包括2-己醛，反式-2-己烯醛，反式-2-壬醛;银川产地的果实醛类香气较低，但其乙酸丁酯，1-辛醇的含量高于其他产地;张掖产地的赤霞珠果实乙酸乙酯，乙醇的含量高于其他产地，其醛类香气高于高台，莱西，银川，但低于蓬莱产地。【结论】各产地香气与气象条件的相关性分析表明生长季7—9月份大温差有利于C6酯类的合成;生长季7—9月份的高日照时数利于C6醇类和C6酯类的合成。

　　关键词：赤霞珠葡萄;气象因子;香气

　　葡萄是世界上最重要的水果之一，种植面积和产量在世界水果中都居前列，以葡萄为原材料加工的产品，如葡萄干和葡萄酒，具有极高的经济价值。葡萄中的挥发性物质是葡萄和葡萄酒的主要品质指标[1]，并且这些挥发物的浓度、特性和彼此之间的平衡决定了不同葡萄品种和葡萄酒的特征。葡萄中的香气一般可分为游离态和糖苷态，但只有游离态的香气才具有挥发性[2]。随着质谱技术的发展，已经鉴定出数百种挥发性有机化合物，它们被分为几个主要家族:萜类、绿叶挥发物、芳香族香气、甲氧基吡嗪类和硫醇类香气[3]。

　　果实种植论文范例： 葡萄果实内油菜素内酯生物合成调控及生理效应

　　绿叶挥发物(GLVs,Greenleafvolatiles)是指以亚麻酸和亚油酸为前体，通过脂氧合酶途径产生的C6/9醛、醇及其酯类化合物，是葡萄果实中含量最高的挥发性物质[4,5]。其中的C6醛类，如己醛，反式-2-己烯醛主要给葡萄带来了清新的绿草的气味，而C6酯类，如乙酸己酯，是葡萄和葡萄酒中果香味特征的组成部分[6]。有报道称葡萄和葡萄酒中除了(Z)-3-己烯-1-醇和(Z)-3-己烯乙酸酯以外的GLVs香气含量会随着葡萄果实含糖量的增加和收获期的推迟而呈上升趋势[7]，而在不同品种的葡萄果实中GLVs香气在果实发育期的变化基本一致[5,8]。

　　关于GLVs的生理功能以及LOX-HPL通路在植物中的调控的研究已经越来越多，而这一途径的生物学意义已得到充分论证[9-11]。迄今为止，GLVs挥发物被认为是植物在生物或环境胁迫下释放的信号。因此，GLVs不仅是葡萄果实和葡萄酒中重要的芳香化合物，而且是一种有效的防御性化合物[12]。葡萄的生长发育和次生代谢都受到葡萄产地的环境因素的影响。而在葡萄栽培中，环境因素和葡萄之间的相互作用被称为“风土效应”。研究表明，葡萄中约18%的基因会受到环境条件的影响，而产地的气候条件对这些基因表达的影响最大[13]。

　　不同的气候条件对果实香气的效应并不一致，而实际上气候对葡萄成分影响的研究可能很难解释，因为气候包括一个区域内的所有环境条件，如阳光、温度、湿度和降雨，这些都对葡萄和浆果的生长发育起着重要作用。例如，光照有利于糖苷态降萜烯的积累[14]，在实际生产中，种植者们往往会采用摘叶，挪叶来提高果穗的曝光度，研究表明这能促进“丹魄”(Tempranillo)葡萄中C6醇和C6酯类香气的合成[15]。还有学者以赤霞珠为试材，发现转色期挪叶会在促进C6醛类香气降低的同时促进C6醇和C6酯类香气的合成，并且在连续三年的试验发现曝光处理会明显提高赤霞珠葡萄中表征红色浆果香气的乙酸己酯的含量[16]。

　　作为葡萄中占比含量最大的香气，绿叶挥发物(GLVs)赋予了果实青草味和成熟的红色浆果香味。然而，当前关于影响GLVs香气形成的关键气象因子的研究还比较少，本课题将以国内七个赤霞珠葡萄主产地成熟期葡萄果实为试材，分析了各产地果实的香气特征和气象条件，并且通过相关性分析进一步地筛选影响果实GLVs香气合成的关键气象因子。该研究将为国内主要赤霞珠产地GLVs香气的品质差异提供一定的解释，并且为果实香气品质调控提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1各产地赤霞珠样品的采集

　　为尽量减小除气象因素以外的生态因素对试验材料的影响，在充分考察了国内十大产地15个采样点的生态条件之后，选取了其中土壤类型一致，土壤肥力相近的七个产地作为采样点。为减少成熟度对果实品质的影响，各产地的果实的可溶固形物基本一致。不同产地的样品采集时兼顾了向阳面和背阳面，每个产地均采集了10kg的葡萄果实用于各类指标的测定。

　　1.2香气组分测定

　　挥发性化合物的提取和测定采用已发表的方法[17]，并进行了少量修改。具体步骤如下，将去籽葡萄果实100g在液氮中研磨成粉末，加入0.5gPVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮，抑制酚类氧化)和0.5gD-葡萄糖酸内酯(抑制糖苷酶活性)。4℃静置4h，4℃4000r/min离心15min，收集上清液。随后，将10mL果汁，1gNaCl粉末(防止样品褐变)和3µL内标(2-辛醇，0.822gL-1)混合放入20mL的小瓶中，用聚四氟乙烯硅样品帽盖住。使用配有AOC-6000自动进样器(日本京都，岛津)的自动顶空固相微萃取(HS-SPME)提取果实香气。

　　SPME纤维(50/30µmCAR/DVB/PDMS，Supelco，Bellafonte，PA，USA)在提取前按照制造商说明在GC的注射口进行预热后(250℃，40min)。将SPME纤维暴露在样品顶空40分钟，35℃条件下萃取40分钟。取样后，将SPME纤维插入GC进样器中，在250℃下放置5分钟，将待测物热解吸。采用三重四级杆气相色谱质谱联用仪GCMS-TQ8050(日本京都，岛津)对挥发性化合物进行分析。采用毛细管柱(rtx-5ms，60m×0.25mm×0.25µm，日本京都，岛津)在载气(氦气)以1mLmin-1流速下分离挥发物。接口温度为250℃，选择不分流模式，柱温箱温度设置为40℃2min，然后以5℃min-1的速度加热至230℃，最后维持在230℃保持5min。

　　质谱和离子源温度分别设置为250℃和230℃。质谱选择电子电离模式(EI)，离子倍增70eV，全质量扫描区间为m/z30-450。使用NIST和Wiley2文库对每个化合物进行鉴定。在相似的色谱条件下测定了一系列C7-C27正构烷烃标准品(Supelco,Bellefonte，PA，USA)，以计算其保留指数(RI)。通过与NIST2011文库的RI和质谱比较，鉴定出挥发性化合物。各组分质谱经计算机谱库(NIST/WILEY)检索及资料分析，再结合相关文献进行人工解析并确认香味物质的各个化学成分，仅保留相似度(SI)大于60，且三次重复均检测到的物质。采用面积归一化法定量，取3次重复平均值作为香气物质的相对含量。

　　1.3各产地气象参数的获取

　　通过中国气象数据网(http://data.cma.cn)、地方气象部门及其他小型气象站，收集了国内七个赤霞珠采样点的气象数据，主要指标包括产地7—9月份的日均温、日最低温、日最高温、降雨量、空气相对湿度、日照时数，以及各站点经纬度、海拔。

　　1.4统计分析

　　使用SPSS(V20.0,IBM,Armonk,NY,USA)软件进行统计分析。香气数据先经SPSS进行数据归一化后进行主成分分析，随后用MicrosoftExcel2016作图。聚类热图，皮尔逊相关性矩阵，典型关联分析使用Omicshare云平台绘制(https://www.omicshare.com/)。单因素方差分析采用邓肯多极差检验(P<0.05)。

　　2结果与分析

　　2.1各产地气候条件的比较

　　为探究七个赤霞珠采样点的气候特征，从国家气象数据网(http://data.cma.cn/)采集了各产地7—9月份的气象信息。数据表明胶东半岛产地(蓬莱，莱西)的平均温度明显高于其他产地。高台和张掖地理位置相距较近，其平均温度基本一致。银川和怀来的均温更为相似，而五家渠的均温最低。相似的趋势也体现在在其他热量指标方面，如最高温，最低温，和活动积温。值得一提的是，银川产地的有效积温明显高于其他产地。

　　由于海洋气候的调节，胶东半岛(蓬莱，莱西)的相对湿度高于其他产地。五家渠，张掖，高台的相对湿度基本都在55%左右。在降雨量上，银川产地在2018年的降雨最多，达到456mm;怀来，蓬莱，莱西的降雨量基本一致，都在300mm左右。张掖的降雨量最低，仅有77.4mm。在温差方面，各产地的温差按照大小排序依次为：高台>张掖>五家渠>怀来>银川>莱西>蓬莱。其中高台产地的温差可达到13.97℃，比蓬莱产地高出98.44%，比莱西高出57.32%。

　　利用皮尔逊相关性检验，进一步探究了环境因子和C6类香气之间的相关性。结果温差与表征果香味的乙酸乙酯，乙酸丁酯呈正相关，也与辛醇，2-己醛，乙醇呈正相关。降雨与绝大部分的香气都呈负相关。有效积温与乙醇和乙酸乙酯呈显著相关。日照时数与醇类酯类总量呈正相关，但与丙烯酸丁酯，庚醛，1-辛醇呈负相关。

　　最高温，平均温与己醛，反式-2-己烯醛无显著相关，但与反式-2-庚醛，丙酸丁酯，1-辛烯-3-酮呈显著负相关。综合典型关联分析和皮尔逊相关性检验的结果，我们发现：生长季7—9月份的温差越大，越有利于C6酯类的合成;生长季7—9月份的日照时数越大，越有利于C6醇类和酯类的合成;生长季的降雨不利于大部分香气的合成。

　　3讨论

　　葡萄果实的风味物质受到产地的“风土效应”的影响，本实验以国内七个地成熟期的赤霞珠果实为试材，探究了各产地的气候特征和香气特征。一般来讲，产地独特的气候特征往往是造成其香气区别于其他产地的主要原因。在本实验中，相较于其他产地，蓬莱产地在果实生长季7—9月份的日照时数最短，平均气温最高，因受海洋气候的调节而温差较小。在香气品质上，蓬莱产地的C6醛类香气和C9醛类香气含量较高，其中包括2-己醛，反式-2-己烯醛，反式-2-壬醛。

　　高含量的醛类香气赋予了蓬莱产地的赤霞珠生硬的青草香。而张掖，高台产地在2018年的日照时数和温差明显高于其他产地，并且降雨较少。在香气品质上，张掖采样点的赤霞珠乙酸乙酯，乙醇的含量高于其他产地，其醛类香气低于蓬莱产地的赤霞珠。因此，张掖产地赤霞珠整体表现为成熟的浆果味和轻微的青草香。银川产地温度适中，日照劣于甘肃产地但优于胶东半岛。而其赤霞珠醛类香气较低，但其乙酸丁酯，1-辛醇的含量高于其他产地，因此银川的赤霞珠主要表现出愉快的果香。

　　值得一提的是，七个产地按照气象因子的相似性进行归类的结果与其按照果实GLVs香气的归类结果并不一致，这主要是因为不同的香气物质对不同的气象因子的响应并不一致，而每一种香气物质和气象因子对聚类分析的结果都有贡献。各产地的气象指标和香气指标的相关性分析表明产地的昼夜温差和日照时数是促进C6酯类和C6醇类合成的关键气象因子，而生长季的降雨不利于大部分香气的合成。相似的结论在前人的工作也有报道。许晓青以国内两个气候特征鲜明的产地(河北昌黎和宁夏高台)的赤霞珠为试材，发现昼夜温差与GLVs香气中C6醛类的含量呈显著相关[18]，相同的结论在Wu的研究中也有报道[19]。

　　众所周知，果域微环境会影响葡萄果实中初生和次生代谢物，而光照是果域微环境中最重要的环境参数。在实际生产中，葡萄栽培者们往往通过在果实不同发育期进行摘叶，挪叶等措施来提高果穗的曝光度，这也是研究光照对果实香气品质影响的普遍的方法。大量的研究表明曝光对于提高果实香气品质是有益的，例如，有研究表明提前摘叶可以降低品丽珠和梅洛葡萄中甲氧基吡嗪的含量[20]。曝光有利于糖苷态降异戊二烯香气，萜烯的积累[14]。

　　不同于昼夜温差和光照，降雨对于大部分香气的积累具有负面影响。作为抗旱能力比较强的物种[21]，普遍认为生长季一定程度的水分亏缺有利于葡萄果实次生代谢品质的形成[22]。因此在酒庄施行调亏灌溉被认为是一种提升葡萄香气的措施。有报道称，适度的水分亏缺可以通过提高葡萄中类胡萝卜素的降解来促进降异戊二烯香气的含量的合成[23,24]。还有报道称水分亏缺不仅会促进赤霞珠葡萄中香气的提升[25]，还能大大增加美乐葡萄中β-大马烯酮，愈创木酚，4-甲基愈创木酚,4-乙烯基愈创木酚的含量[26]。

　　4结论

　　生长季7—9月份的大温差有利于C6酯类的合成，生长季7—9月份的高日照时数有利于C6醇类和C6酯类的合成。

　　参考文献References

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　　作者：刘孟龙，李响，高振，杜远鹏*