亲水胶体对海绵蛋糕中晚期糖基化终末产物的抑制作用

　　摘要：海绵蛋糕备受广大消费者喜爱，但高温焙烤的加工方式使其产生多种有害产物，如晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproducts，AGEs)、二羰基化合物、蛋白质氧化产物等。本文为了探究亲水胶体对AGEs生成的抑制作用，首先采用牛血清白蛋白(bovinealbumin，BSA)-果糖(fructose，Fru)，BSA葡萄糖(glucose，Glu)、BSA-丙酮醛(methylglyoxal，MGO)，BSA-乙二醛(glyoxal，GO)等4个化学模型，考察了9种经典亲水胶体在化学模型中的抗糖基化能力，筛选出抑制效果最佳的海藻酸(alginicacid，ALA)和黄原胶(xanthangum，XG)作为研究对象，探究了不同亲水胶体添加量(0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%,w/w)以及烘焙温度、时间对海绵蛋糕品质属性、AGEs形成和蛋白氧化产物的影响。明确了最佳烘焙温度和时间为180℃/40min，在此条件下分别添加0.5%(w/w)的ALA或2.0%(w/w)XG能够显著降低海绵蛋糕中的荧光AGEs，非荧光AGEs和蛋白氧化产物含量。同时，ALA和XG的添加能够改善蛋糕的质构，提高蛋糕的水分含量。综上所述，ALA和XG是一类很有前途的天然AGEs抑制剂，可以在烘焙之前添加至原料中，以减少烘焙食品中AGEs的生成。

　　关键词：海绵蛋糕;亲水胶体;海藻酸;黄原胶;晚期糖基化终末产物(AGEs)

　　海绵蛋糕因其口感、风味而备受消费者喜爱，但高温烘焙的加工方式以及烘焙过程中发生的美拉德反应使其产生一系列具有潜在健康危害的化合物的，如晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproducts，AGEs)、二羰基化合物、蛋白质氧化产物等。

　　AGEs是由还原糖中的羰基与蛋白质、脂类和核酸中的游离氨基反应形成的一类糖基化产物[1]。AGEs包括具有荧光的交联AGEs(如戊糖素)，没有荧光的交联AGEs(如精氨酸-赖氨酸咪唑复合物)及没有交联的AGEs(如Nε-羧甲基赖氨酸(Nε-carboxymethyllysine，CML)和Nε-羧乙基赖氨酸(Nε-carboxyethyllysine，CEL))[2]。其中，CML和CEL是AGEs最主要的单体之一。目前已经有研究表明，食源性AGEs的摄入会增加人体血清中AGEs的水平，进而引发或加速许多慢性疾病，如癌症，炎症，糖尿病，动脉粥样硬化和肾小球硬化[3,4]。

　　根据是否与蛋白质或多肽结合，AGEs可分为结合态和游离态[5]。与结合态AGEs相比，游离态的AGEs更容易被人体吸收进入血清中[6]。由于烘焙食品大都具有高糖、高脂特点，且经高温烘焙制得，制备过程中更容易因美拉德反应生成AGEs。因此，如何抑制烘焙过程中AGEs的生成是食品工业迫切需要面对的问题。目前研究较多的是在食品中添加植物多酚作为AGEs抑制剂，如白藜芦醇能够显著降低中等水分食物中AGEs和不溶性蛋白水平[7]，在曲奇中添加迷迭香酸、白藜芦醇和表儿茶素对AGEs抑制率可达28.60%~62.05%[8]。

　　但多酚易降解，同时也会极大地抑制风味物质的形成，这都会影响食品品质和AGEs抑制效果。MILDNER-SZKUDLARZS等人[9,10]在面团中加入2g/100g咖啡酸，没食子酸，阿魏酸，儿茶素和槲皮素后，经过210℃烘焙20分钟，面包屑中的阿魏酸，咖啡酸和儿茶素的含量分别减少75%，47%和51%，同时美拉德反应产生的挥发性风味化合物分别降低了75.9%，74.3%，65.6%，62.4%和59.3%。

　　亲水胶体大多数是多糖大分子及其衍生物，分子结构中含有大量的亲水基团，例如羧基，羟基，氨基等[11]。在食品工业中，亲水胶体常被用于增稠、保水、凝胶、乳化、稳定等作用，不仅能够改善食品品质，还具有营养价值[12,13]。在面团烘焙前，加入适量的亲水胶体，如黄原胶(xanthangum，XG)，羟丙基纤维素，海藻酸钠，结冷胶等，蛋糕的品质可以被改善，水分含量提高，储藏时间延长[14-16]。

　　近年来，多种亲水胶体被报道能够抑制有害美拉德反应产物的生成，如丙烯酰胺(Acrylamide，AA)，杂环胺(heterocyclicamine，HAs)和AGEs。壳聚糖，柑橘果胶(orangepectin,OP)，瓜尔胶，羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)，海藻酸(alginicacid，ALA)和XG均被报道具有显著抑制食品加工过程中AA生成的能力[17-19]。羧甲基纤维素钠，壳聚糖和κ-卡拉胶在抑制HAs上也表现出了良好的效果，在牛肉饼模型中，它们对主要HAs的抑制率分别可达78.8%，61.1%和90%[20,21]。

　　本研究评价了9种亲水胶体，包括植物胶(角豆胶(Carobgum，CG)、柑橘果胶(orangepectin，OP))、动物胶(明胶(Gelatin，GEL))、微生物胶(XG)、海藻胶(琼脂(agar，AG)、ALA、卡拉胶(carrageenan，CAR))和化学改性胶(CMC、羟丙基磷酸双淀粉(hydrogenphosphate，HDP))。在糖基化化学模型中对AGEs形成的抑制作用。选出抑制效果最佳的两种亲水胶体，分别加入海绵蛋糕，评价两者对其品质及AGEs形成的影响，为海绵蛋糕以及烘焙类休闲食品的安全生产提供理论基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　牛血清白蛋白(bovinealbumin，BSA)、AG(150~250mPa·s)、CAR(≥0.005Pa·s)、MGO(质量分数40%溶液)、乙二醛(glyoxal，GO)(质量分数40%溶液)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;ALA(300~500mPa·s)、XG(2500~3000mPa·s)、正己烷(色谱纯)、甲醇、甲酸均为质谱纯美国Sigma-Aldrich公司;果糖(fructose，Fru)、葡萄糖(glucose，Glu)、CMC(2500~4500mPa·s)、GEL(5~20mPa·s)、磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer，PBS)、邻苯二胺上海麦克林生化科技有限公司;CG(300~600mPa·s)、HDP(900～1100mPa·s)、OP(100~200mPa·s)上海源叶生物科技有限公司。

　　1.2仪器与设备

　　F-7000型荧光分光光度计日本日立公司;SPX-250B-2型恒温生化培养箱上海博迅实业有限公司;SCIEXTripleQuad6500+LC-MS/MS质谱仪美国Agilent公司;WatersACQUITYUPLCIClass超高效液相色谱美国沃特世公司;SHA-CA型数显恒温水浴振荡器常州普天仪器制造有限公司;DK-320S数显恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司;DK-TO02电烤箱广东新宝电器股份有限公司;CR-400便携式色差仪日本美能达公司;Ez-Test-500N质构仪日本岛金公司。

　　1.3方法

　　1.3.1糖基化化学模型中9种亲水胶体对AGEs抑制效果的评价1.3.1.1BSA-Fru/Glu模型的建立BSA-Fru和BSA-Glu模型的建立参考Wang等人[22]和Peng等人[23]的方法，稍加修改。用50mmol/LPBS(含0.02%NaN3pH7.4)分别配制60mg/mLBSA溶液、1.5mol/LFru溶液和0.8mol/LGlu溶液。取1mLFru或Glu溶液，1mLBSA溶液和1.0%(w/w)的亲水胶体加入有螺帽的10mL试管中混匀作为实验组[18]，空白组不加亲水胶体，作为对照。在恒温培养箱中37℃孵育7天后，测定反应体系中荧光AGEs含量。每个样品做3组平行。

　　1.3.1.2BSA-MGO/GO模型的建立BSA-MGO和BSA-GO模型的建立参考按照Wang等人[24]的方法，但稍加修改。用50mmol/LPBS(含0.02%NaN3pH7.4)分别配制30mg/mLBSA、60mmol/L的MGO和GO溶液。取1mLMGO或GO溶液和1.0%(w/w)的亲水胶体在有螺帽的10mL试管中混匀作为实验组，空白组不加亲水胶体，作为对照。在37℃孵育2h后，分别在试管中加入1mL30mg/mLBSA继续孵育7天后测定荧光AGEs含量。每个样品做3组平行。

　　1.3.2化学模型中荧光AGEs测定方法参考Huang等人[25]的方法，取1.3.1.1、1.3.1.2模型反应体系中的液体样品通过F-7000型荧光分光光度计测量激发/发射波长325/440nm处的荧光强度来确定溶液中荧光AGEs的含量。

　　1.3.3化学模型中ALA和XG添加量对AGEs形成的影响

　　选用1.3.2中筛选出的对荧光AGEs抑制效果最佳的ALA和XG作为研究对象。分别将1.3.1.1、1.3.1.2实验组中1.0%(w/w)的亲水胶体分别替换为0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(w/w)的ALA和XG，其它步骤不改变。孵育后测定各个模型体系中荧光AGEs，蛋白氧化产物，游离态和结合态CML和CEL的含量，进一步探究在BSA-Fru/Glu和BSA-GO/MGO模型中，ALA和XG添加量对AGEs形成的影响。每个样品做3组平行。

　　1.3.4化学模型中非荧光性AGEs含量测定方法游离态CML和CEL检测样品的前处理参考卞华伟等人[26]建立的方法，即将模型反应体系中液体样品用Milli-Q水稀释至5mL。7000g/min，4℃离心15min。取1mL上层清液，过固相萃取柱(CleanertPCX,150mg/6mL)去除杂质。

　　然后加3mLMilli-Q水洗脱，收集洗脱液，过0.22μm尼龙膜后待测。结合态CML和CEL检测样品的前处理参考Assar等人[27]和Chen等人[28]的方法。向前处理完成后的样品中加入Milli-Q水定容至50mL，使用0.22μm的有机滤头过滤。取1mL滤液，通过预先平衡好的固相萃取柱(CleanertPCX,150mg/6mL)，收集液体待测。采用SCIEXTripleQuad6500+UPLC-MS/MS对CML和CEL进行定量分析，测量方法参考Chen等人[28]。利用X-BridegeC18柱(4.6mm×150mm，5μm)对CML和CEL进行了色谱分离，线性范围为3~300ng/mL。

　　UPLC条件：X-BridegeC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm);流动相为A相(0.3%(v/v)甲酸水溶液)和B相(甲醇);流动相流速0.3mL/min;柱温30℃;进样量2μL。采用以下梯度洗脱：0~0.4min，10%B;0.4~3.5min，10%~60%B;3.5~4.0min，60%~10%B;4.0min~6.0min，10%B。MS/MS条件：ESI+模式。监测方式：MRM模式;离子源温度300℃;锥孔电压20eV;毛细管电压4kV。CML：205>84;CEL：219>84。

　　1.3.5ALA和XG添加量对MGO和GO清除率的影响

　　参考王佳琦等人[29]建立的方法，向10mL试管中分别加入2mL60mmol/LMGO或60mmol/LGO，然后分别加入0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(w/w)的ALA或XG，混匀。在90℃油浴锅中避光反应30min后迅速取出试管，冰浴冷却终止反应。

　　空白组则不添加ALA和XG，作为对照。测定样品中MGO或GO残留量。由于二羰基化合物无法直接测定，将MGO和GO衍生成甲基喹诺啉和喹诺啉，然后用SCIEXTripleQuad6500+UPLC-MS/MS进行定量。标准品和样品按照赵琼晖等人[30]建立的方法衍生化处理后过0.22μm膜后注入SCIEXTripleQuad6500+UPLC-MS/MS进行定量。UPLC条件：X-BridegeC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm);流动相为A相(0.1%(v/v)甲酸水溶液)和B相(0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液);流动相流速0.5mL/min;柱温30℃;进样量2μL。采用以下梯度洗脱：0~1.0min，60%A;1.0~3.0min，60%~30%A;3.0~4.0min，30%~60%A;4.0min~6.0min，60%A。

　　MS/MS条件：ESI+模式。监测方式：MRM模式;离子源温度300℃;锥孔电压20eV;毛细管电压4kV。MGO衍生物：145>77;GO衍生物：131>104。按公式(1)计算ALA和XG对MGO或GO的清除率。每个样品做3组平行。

　　1.3.6烘焙温度和烘焙时间对海绵蛋糕中AGEs含量和品质的影响

　　1.3.6.1海绵蛋糕样品的制备蛋糕的基本配方为100g低筋面粉，100g鲜鸡蛋，白糖100g，含盐黄油10g。蛋糕的制备方法参照Wang等人[31]，每个面糊的质量为100g，面糊分别在不同的温度、时间下进行烘焙(155℃下分别烘焙30、35、40、35、50min;180℃下分别烘焙25、30、35、40、45min;205℃下分别烘焙15、20、25、30、35min;230℃下分别烘焙15、17、19、21、23min)。冷却后，蛋糕被细磨并储存在-20℃以作进一步分析。每组处理的蛋糕做3个平行。

　　1.3.7ALA和XG添加量对海绵蛋糕中AGEs含量和品质的影响分别将0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(w/w)ALA或XG与100g低筋面粉混合，亲水胶体的百分比是以面粉的质量为基础。按1.3.7.1节的方法制备蛋糕，每个面糊在180℃的烤箱中烘焙40min。不添加ALA和XG的海绵蛋糕作为空白对照组。按1.3.7.2节和1.3.7.3节中的方法测定不同ALA和XG添加量对海绵蛋糕色度、水分含量以及荧光AGEs、蛋白氧化产物、结合态和游离态CML和CEL含量的影响。蛋糕的老化程度由硬度的变化率来表示，用质构仪测定室温放置0d和4d的海绵蛋糕硬度，分别记为H1和H2，硬度变化率按公式(4)计算。硬度变化率/%=

　　2结果与分析

　　2.1化学模型中亲水胶体对荧光AGEs生成量的影响

　　以荧光强度为指标，考察了9种亲水胶体对4个不同阶段糖基化反应化学模型(BSA-Fru、BSA-Glu、BSA-MGO和BSA-GO模型)中荧光AGEs生成量的影响。选用BSA-Fru/Glu模型用来评估整个糖基化反应的过程，其中Fru的羰基结构与氨基残基反应的程度高于Glu，反应比Glu更活跃[33]。二羰基化合物(如GO和MGO)与蛋白质的氨基酸残基发生不可逆的反应，最终导致AGEs的形成[34]。

　　因此BSA-GO/MGO模型通常用于评估蛋白质糖基化的中间阶段。BSA-Fru中，在1%(w/w)添加量下，除了CG与空白组对比不显著外，其他不同亲水胶体都能在一定程度上降低荧光性AGEs的形成。其中，XG和ALA显著降低了荧光AGEs的荧光强度(P<0.05)，抑制率可达34.55%和25.20%。

　　在BSA-Glu模型中，9种亲水胶体抑制荧光AGEs生成的顺序同BSA-Fru模型相似。在BSA-MGO/GO模型中，XG和ALA均显著降低荧光AGEs的形成，推测两种胶体可能是通过阻止二羰基化合物与蛋白质结合来抑制AGEs的生成。对比BSA-GO和BSA-MGO反应模型，后者中所有亲水胶体的荧光AGEs的抑制率明显高于前者，且与空白相比抑制效果更显著。

　　这意味着亲水胶体可能对BSA与MGO的结合具有更强的抑制作用。研究发现，多酚的羟基和羧基可以与MGO和GO发生亲电取代反应[8]，而氨基酸主要是通过氨基对二羰基化合物的加合作用来阻断AGEs的形成[35]。因此，含有羟基、氨基和羧基的亲水胶体可能具有与多酚和氨基酸类似的AGEs抑制机制。在上述四个化学模型中，不同亲水胶体对AGEs形成的抑制效果不同，这可能是由于胶体中不同官能团的亲核性不同[21]。综上，选用AGEs抑制效果最佳的ALA和XG进行后续研究。

　　2.2化学模型中ALA和XG添加量对AGEs生成量的影响

　　2.2.1添加量对荧光AGEs生成量的影响

　　ALA和XG的添加量对BSA-Fru、BSA-Glu、BSA-MGO和BSA-GO模型中的荧光AGEs抑制作用。ALA对化学模型中荧光性AGEs的抑制作用随着添加量的升高而增强。

　　当添加量达到2%(w/w)时，ALA对BSA-Fru、BSA-Glu、BSA-MGO和BSA-GO模型的荧光AGEs抑制率分别达到33.26%、21.25%、45.65%和21.07%，这说明ALA对荧光AGEs有良好的抑制效果，且抑制率与ALA的添加量呈正相关。在BSA-Fru和BSA-Glu模型中，当XG增加至0.5%(w/w)时，荧光AGEs含量显著降低(P<0.05)，当其添加量从0.5%增加至2.0%(w/w)时，荧光AGEs含量逐渐升高。这可能是由于XG在高添加量下黏度增加，阻碍了体系内反应的进行[36]。在BSA-MGO模型中，ALA和XG的抑制效果均随着添加量的增加而升高，推测是ALA和XG与MGO之间发生了反应从而抑制了AGEs的生成，这意味着更多的二羰基化合物变成了其他产物[37]。

　　2.3烘焙条件对海绵蛋糕中AGEs含量和品质的影响

　　2.3.1烘焙条件对海绵蛋糕中AGEs和蛋白氧化产物含量的影响

　　蛋白质的氧化通常伴随着AGEs的形成，蛋白氧化产物的含量是测定AGEs生成的一个重要标志。在AGEs形成的过程中蛋白质被氧化成二酪氨酸,犬尿氨酸和N′-甲酰犬尿氨酸[39]。其中，犬尿氨酸在人体内的产生与神经退行性疾病(如阿尔兹海默症、帕金森症等)、炎症和抑郁症等病症有关[40]。在未烘焙之前，面糊中荧光AGEs和蛋白氧化产物的荧光强度为0，非荧光AGEs含量低于3ng/mL，可忽略不计。

　　烘焙后荧光性AGEs倾向于在低温烘焙条件下积累。在烘焙初期，荧光性AGEs快速累积达到峰值后开始出现下降趋势，温度越高达到峰值所需的时间越短。当烘焙温度为155℃时，荧光AGEs和蛋白氧化产物含量直到50min也未达到峰值。而在180℃下，35min时出现荧光AGEs的峰值，随后40min和45min含量相对于峰值分别下降15.23%和24.55%。

　　当焙烤温度为230℃时，荧光AGEs含量在17min时即达到峰值，随后大幅度下降，同时二酪氨酸含量也发生了下降，较15min时下降了12.61%，在19min时又出现上升趋势。游离态和结合态CML含量随着烘焙温度升高的变化趋势与荧光性AGEs相同，在初期快速积累，达到峰值后出现下降，而CEL受烘焙温度的影响不明显，这可能是由于烘焙强度的增大使CML发生分解或参与其他反应，如形成类黑精等[41]。高温的烘焙方式会减少AGEs在蛋糕中的累积，如205℃下烘焙21min和23min的蛋糕中荧光AGEs、非荧光AGEs及蛋白氧化产物含量均显著低于其他烘焙条件下的蛋糕。

　　2.4ALA和XG添加量对海绵蛋糕品质、AGEs和蛋白氧化产物含量的影响

　　2.4.1添加量对海绵蛋糕品质的影响

　　海绵蛋糕中加入适量亲水胶体能够改善结构，提高水分含量，延长储藏时间和延缓淀粉的老化作用[42]。添加ALA和XG的海绵蛋糕品质属性分析。与空白对照组相比，除了ALA添加量为0.5%和1.5%(w/w)以及XG添加量为1.5%(w/w)时，其他添加量的ALA和XG对海绵蛋糕的颜色(E值)均不产生显著影响(P>0.05)。

　　储藏期蛋糕的硬度变化率与蛋糕的老化程度呈正相关，其中数据可以看出ALA和XG的加入明显降低了放置4d的蛋糕硬度变化率，提高了海绵蛋糕的水分含量，说明亲水胶体的加入可以延缓蛋糕中淀粉的老化，这可能是因为海藻酸在蛋糕组织中形成保水性较好的凝胶结构，ALA添加量的增大使得分子间相互作用增强，凝胶性能也更好，持水能力得到增强[43]。而黄原胶作为一种天然多糖大分子，能够填充到蛋糕膨胀的淀粉三维网状组织中，形成膜壁，从而阻碍淀粉羟基之间的缔结，进而增大海绵蛋糕的水分含量和持水能力[44]。

　　结论

　　本实验在糖基化化学模型中证明了ALA和XG具有良好的荧光AGEs抑制能力，且AGEs抑制率随着ALA添加量的增加而提高，XG添加量在低浓度时的抑制率高于高浓度，二者对蛋白氧化产物也有良好的抑制作用。此外，实验还证明了ALA或XG能够显著降低二羰基化合物MGO和GO的含量，当二者添加量为2.0%(w/w)时，MGO清除率分别为34.92%和42.08%，GO清除率分别为14.45%和21.48%，推测原因可能是ALA和XG能够捕获MGO和GO形成加合产物。烘焙条件对蛋糕的品质属性和AGEs生成量均有显著影响，随着温度的上升和时间的延长，蛋糕的颜色加深，硬度增加，水分含量降低。

　　蛋糕中游离态和结合态的CML、CEL含量均随着烘焙时间的延长呈现出先上升后下降的趋势，焙烤温度升高会使CML积累量的峰值提早达到，CEL则受温度影响较小。结合品质属性和AGEs含量，确定了最佳烘焙条件为180℃烘焙40min。蛋糕中亲水胶体最佳添加量为2.0%(w/w)ALA或0.25%(w/w)XG，在此浓度下，蛋糕的品质属性良好且AGEs含量较低。

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　　作者：王申宛1,2，郑晓燕2，艾斌凌2，郑丽丽2，杨旸2，校导2，张海德1,*，盛占武2,*