植物低温胁迫响应及研究方法进展

　　摘要:低温是植物生长过程中面临的主要非生物胁迫之一，植物的生长发育与生理代谢直接受到低温的影响。低温胁迫下，植物从内源激素、膜质组成、抗氧化成分及基因转录水平等多个方面做出复杂而剧烈的响应，因此，植物抗寒性研究是农业和植物领域研究的热点之一。本文从植物形态特征、生理生化变化、分子水平响应等方面系统论述植物低温胁迫响应机制;比较了直接、间接和综合评价植物耐低温性的研究方法;分析了植物抗冻锻炼、外源生长调节剂调控、基因工程等途径提升植物耐低温性的效果，并对以后的研究方向进行展望。

　　关键词:低温胁迫;响应机制;研究方法;耐低温性

　　霜冻、寒潮及低温冷害是出现于早秋和晚春时节的主要农业气象灾害。在全球气温变暖的大环境下，由于低温灾害频繁发生，严重影响到我国农林业的发展(2018年4月份中国西北、华北等地遭受严重低温冻害，其中甘肃省蔬菜、果树、花椒等农作物受灾33.583万hm2，绝收10.174万hm2)。关于植物低温胁迫机制的研究主要从外观形态和生理生化变化以及分子应答等方面展开，随着研究的深入，重点趋向于低温响应关键基因的信号调控网络研究，其中转录因子和miRNA成为研究热点。

　　由于低温胁迫类型复杂，植物对低温的适应性受多基因调控，不同作物低温评价指标和标准难以统一，在植物抗寒评价方法方面进展缓慢，制约了植物耐寒资源的鉴定和机制研究工作的深入开展。本文主要从植物低温胁迫响应的机制、植物耐低温性研究方法和提高植物耐低温性途径等方面展开综述，旨在为植物抗寒性研究提供理论参考。

　　1植物低温胁迫响应机制

　　1.1植物低温胁迫下的形态特征

　　在低温胁迫下，形态特征变化是植物受到胁迫最直观的体现，轻而长期低温会使植株生长迟缓、苗弱、萎蔫、黄化、坐果率低、产量降低和品质下降[1-2];重而短时低温下植株叶片明显褐变，叶片叶柄软化，透明，呈水渍状，出现脱水现象，组织柔软并萎蔫皱缩，冻害斑点明显[3]。

　　研究发现，植物的组织结构特点与抗寒性具有密切相关性，包括植物的叶片厚度、气孔密度、鳞芽有无、根冠比大小、花器官大小以及厚度、栅栏组织/海绵组织大小等[4]。抗寒性较强的植物的叶片气孔密度较小，角质层和上下表皮比较厚，叶肉细胞排列紧密，叶片组织结构也比较紧密，根冠比较大[5]，细胞间空隙小，枝条木质部、韧皮部和髓的褐变程度较小[6]，有的具有冬芽结构[7]。

　　杨宁宁等对北方油菜抗寒性研究结果表明，抗寒性强的冬油菜苗期表现匍匐生长，栅海比小，气孔面积小，地下部干质量大[5]。田雪飞研究发现，植物遭受一定低温后引起了叶片叶缘失绿，根系受损甚至枯死，开花结实率下降，果实畸形，甚至植株死亡[8]。许瑛等对菊花叶片解剖结构紧密度指标的分析表明，抗寒性强的菊花品种叶片和上表皮较厚，栅栏组织发达，叶肉细胞排列紧密，胞间空隙小，抗寒性差的品种则表现为叶片上表皮较薄，栅栏组织层数少、厚度薄，叶肉细胞排列疏松，细胞间隙大[9]。

　　何煜明等研究表明，在水稻幼苗期进行低温胁迫，因其叶片受到低温冷害，会使其半饱和光强降低，对光能利用率产生影响，同时，水稻叶片对于光强的耐受程度也大幅下降[10]。姚利晓等在研究中表明，低温条件下，转基因甜橙的叶片伤害率随温度梯度在一定范围内呈“S”形变化[11]。曹红星等解剖低温处理下椰树叶片的结构发现，随着温度的下降，细胞间隙越大，海绵组织和栅栏组织结构愈发不规则[12]。

　　1.2植物在低温胁迫下的生理生化变化

　　植物在低温胁迫下的生理生化变化主要体现在:叶绿素合成受阻，各种光合酶活性受到抑制，故而使光合速率下降[13];光合作用减弱;呼吸代谢失调[14];细胞膜系统受损，体内的各种代谢发生紊乱;植物体内的渗透物质和水含量也会有改变。低温条件下，植物的呼吸作用在冷害初期短时加强后随温度的下降而下降[15]。

　　孙双印对低温(25℃为对照、10、5、0℃为处理，处理时间为1d)胁迫下白玉兰与紫叶李光合生理特征研究显示，温度通过影响核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)活性限制和RuBP再生速率来控制叶绿体的光合速率，与正常温度相比，低温处理下的羧化效率总体较低[16]。我们发现马铃薯在同等光合有效辐射下，净光合速率随环境温度的下降而降低，不同基因型马铃薯对10℃温度的适应性有差异，10℃条件下的马铃薯净光合速率与基因型耐寒性呈正相关[17]。

　　低温逆境下植物细胞出现收缩，细胞膜的形态和结构发生改变，膜脂从液晶态变成凝胶态，细胞膜一旦受损，离子发生外渗，细胞导电性就会相应发生变化。植物在代谢过程中会产生活性氧(ROS)，活性氧参与细胞内的生理生化反应，在植物正常生长的情况下，ROS分子能够被氧化防御机制清除，即植物的保护性应急反应[18-19]。

　　但是，在低温、干旱或者盐等逆境胁迫环境中，活性氧的动态平衡会被打破，且ROS含量急剧増加，从而对植物造成伤害，产生伤害的可能原因是低温胁迫超出了植物承受的极限，酶的结构发生了改变[20]。刘贝贝等研究表明，在低温胁迫下，不同石榴品种的SOD活性呈一直上升趋势或者先上升后下降趋势，并且不同品种增加的幅度不同，到达峰值的温度也不同[21]。植物组织中自由水含量、结合水含量、总含水量以及自由水与结合水含量的比值可以作为评价植物抗寒性的指标[22]。

　　吴飞等研究显示，随着处理温度的下降，总含水量逐渐降低。在一定的范围内，随处理温度的降低，自由水/束缚水比值逐渐下降;超过一定的范围，虽然自由水和束缚水含量缓慢下降，但比值几乎不再有变化。自由水/束缚水比值较低，说明细胞液浓度高，保水能力强，抗寒能力较强[23]。

　　渗透调节物质的变化与植物的低温胁迫也有联系，可溶性蛋白和脯氨酸的研究较多。可溶性蛋白是一种能够提高植物保水能力和降低细胞组织间结冰可能性的亲水性较强的渗透调节物质。王卓敏等研究发现，抗寒性较强品种的可溶性蛋白含量随着低温胁迫时间的延长呈上升的趋势，但是不同品种间存在差异，有些品种则先上升后趋于平缓，还有一些品种可溶性蛋白含量变动不显著[24]。脯氨酸是一种亲水性有机溶剂，与细胞水势呈负相关。有学者研究发现马铃薯植株脯氨酸含量与抗寒性之间具有高度相关性，抗寒性越强的植株脯氨酸含量越高[25]。

　　1.3植物低温胁迫下的分子响应

　　目前，低温信号途径研究得比较清楚的是CBF[C-repeat(CRT)-bindingfactors]依赖的信号途径，该途径属ABA非依赖性，在CBF途径中，CBF1、CBF2和CBF3是目前研究热点，CBF1与CBF2和CBF3同属一小蛋白家族，且发现CBF2对CBF1、CBF3负调控，即CBF2能够阻遏调节CBF1、CBF3的表达[26]。

　　CBF基因受到低温、光照、周期节律等的调控，因此，CBF信号途径是低温信号与其他信号相互作用的重要桥梁。研究显示，植物体内含有钙离子信号途径和ICE1(inducerofCBFexpression1)-CBF-寒冷响应途径调节CBF基因的表达[27]。

　　质膜感受到冷信号，胞质中的三磷酸肌醇(IP3)含量发生变化，胞质内钙离子的积累，并与钙调蛋白结合转录因子(CAMTA3)形成复合物，CAMTA3与CBF2启动子上CG-1元件结合，激活CBF的表达。ICE1是类似MYC的bHLH转录因子，可特异地结合到CBF3启动子的MYC作用元件，激活CBF3的表达，表达产物CBF结合到多种寒冷和脱水应答基因，包括它们启动子的CCGAC核心基序上，进而诱导这些功能基因表达，最终使植物获得低温耐受能力[28]。

　　构建转录调控网络以及鉴定参与网络的转录因子对阐明植物逆境应答机制和挖掘抗逆分子改良有着重要的意义。NAC转录因子是植物特有的一类转录因子，在抵御逆境反应中发挥着重要作用，其数量众多，广泛分布于陆生植物中[29]。

　　NAC蛋白的N端含有较为保守的DNA结合域，C端有的是序列高度可变的与转录激活活性调控多样性有关的TRR区域，有的是负责与质膜或内质网膜锚定的α螺旋跨膜基序(TM)[30]。边境等利用IlluminaHiSeq技术，分别构建了5℃和22℃处理下的2个玉米叶组织转录组。从转录组数据中共分离出30条上调和8条下调的低温响应NAC基因，这些NAC被分为12个亚族(NACa-1)，其中7条上调低温响应NACs属于逆境相关亚家族(Stressrelated/NAC-h)[31]。

　　黄荣峰等研究表明，低温锻炼是提高植物对低温的抗性并诱导产生冷反应基因的途径之一。拟南芥的COR(cold-regulated)基因是冷反应基因之一，冷反应基因编码的多肽产物均具有亲水特性、简单的氨基酸组成和重复的氨基酸序列，且在水相缓冲液中呈可溶状[32]。Catalá等研究发现，14-3-3基因的表达会使植物对各种逆境环境产生反应，罕见的冷诱导1A(RCI1A)基因编码14-3-3psi异构体，并通过控制冷诱导的基因表达对拟南芥的耐寒和冷驯化起负调控的作用[33]。

　　SatoshiKidokoro等研究发现，钙调蛋白结合转录ACTIVATOR3(CAMTA3)和CAMTA5会对迅速降低温度和诱导DREB1s的表达做出反应，但是这些蛋白质对温度逐渐降低不会做出反应[34]。miRNAs通过对靶基因mRNA进行切割或翻译抑制调节mRNA的表达，在植物生长发育和环境胁迫响应中起到重要的作用[35]。

　　安凤霞等在抗寒品种中检测到34个上调表达，43个下调表达的miRNA，在低温敏感品种检测到50个上调表达，45个下调表达miRNA，这些保守或非保守miRNA在植物的生长发育以及抵御低温逆境过程中起作用[36]，笔者所在课题组研究也发现经过冷驯化的马铃薯中其miR390通过负调控富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶基因(LRR-RLK)对低温产生响应(待发表)。

　　肖仕等的研究揭示了冷害胁迫下拟南芥二酰甘油酰基转移酶DGAT1和二酰甘油激酶DGK2、DGK3和DGK5调控二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)和磷脂酸(PA)的动态平衡，维持膜系统的完整性及细胞内氧还状态，从而影响植物对冷害的抗性反应。植物遭受低温逆境时，细胞内脂质代谢活动十分活跃，拟南芥细胞内的DAG、TAG和PA各组分的含量在低温胁迫下均显著升高。

　　植物在冷胁迫下，直接参与抗逆性反应的基因被诱导表达，这些基因的表达产物主要分为调控蛋白和功能蛋白。常见的调控蛋白包括钙调蛋白(calmodulins，CaMs)、钙依赖性蛋白激酶(CaMdomain-containingproteinkinases，CDPKs)、类钙调磷酸酶B蛋白(calcineurinB-likeproteins，CBLs)、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)和互作蛋白激酶(CBL-interactingproteinkinases，CIPKs)等;常见的功能蛋白包括胚胎后期丰富蛋白(LEA)、热休克蛋白(HSPs)、渗透调节物质的生物合成所需的酶、防冻剂和解毒蛋白质。

　　2植物耐低温性研究常见的方法

　　2.1直接鉴定法

　　植物耐低温性大田直接鉴定法是应用最广泛的一种鉴定方法，包括田间自然鉴定法、生长恢复法、人工模拟气候室法等[4]。田间鉴定法是根据季节温度的变化规律，按一定的标准比较植物的器官、组织的受冻情况，根据植物叶片的颜色、水渍斑以及茎杆的透明度来评价植物的抗冻性。植物受冻害程度越低，说明抗寒性越强，抗寒性强的品种，评分也就越低。

　　田间鉴定法大多采用聚类分析法来分析，聚类分析法是将样品按相似程度划分类别，使得同一类中元素之间的相似性比其他类元素相似性更强的一种理想的多变量统计技术。刘艳等通过系统聚类和相关性系数法来探讨各植物间的亲缘关系。得出聚类分析法在植物物种分类及鉴别中是一种可行性手段，其结果与相关性分析结果相吻合[37]。

　　魏亮等的研究结果显示，马铃薯材料损伤评分为2，损伤较轻，抗寒性较好;损伤评分为6，植株基本死亡，抗寒性最差[38]。田间自然霜冻法的分级细致合理，适合大批量的实验材料，但是同时，该方法周期性长，重复性差，受季节的限制。生长恢复法是将植物材料放在不同的温度梯度下进行处理，取出后放在适宜生长的条件下测定恢复生长的最低温度，确定它们抗寒性的一种比较可靠并普遍应用的方法[4]。

　　田娟等利用电导率对植物抗寒性进行比较，得出随着胁迫程度的加深和胁迫时间的持续延长，植物均呈现出膜相对透性逐渐增大的趋势，但不同品种间的增幅却各不相同[39]。人工模拟气候室法是一种周期较短、可重复性高、不受季节限制的方法，但是模拟人工气候室的成本较高，并且人工气候室的空间条件有限，难以进行大批量的材料处理。

　　2.2间接鉴定法

　　植物耐低温性间接鉴定法包含很多的鉴定指标，主要有细胞膜电解质的测定、氧化还原酶系统、可溶性糖含量的测定、脯氨酸的测定、叶绿素荧光的测定以及DAB组织定位等。细胞膜系统通常是最先受到低温伤害的部位，逆境导致细胞膜透性加大，细胞内物质向膜外渗透，电解质渗透增大。测定电解质渗漏一直被用作衡量细胞膜结构在逆境中稳定性的一项重要指标，通过定义电解质透出率达50%时的温度为半致死温度[40]。

　　进一步优化利用logistic曲线描述低温对植物细胞膜的伤害过程，Rajashekar等提出曲线拐点为LT50的观点[41]并在我国得到了广泛认同。李飞等成功地运用该方法对马铃薯资源进行了抗寒性鉴定[42-45]。相对电导率法技术完善，不受季节的限制应用广泛，不足之处是该方法比较繁琐、周期长、重复性不好，不适合大批量的材料的筛选。林艳等探究了不同大叶女贞品种的抗寒性，随着幼苗叶片处理时间的延长，其丙二醛和可溶性糖含量逐渐上升[46]。

　　刘贝贝等对6种石榴品种低温处理，发现抗寒性较强的材料脯氨酸含量先上升后下降，抗寒性较弱的品种随着冷胁迫的处理脯氨酸含量不断上升[21]。丁旭等研究发现，随冷冻胁迫加强，马铃薯叶片斑块越多，说明抗冻能力越差[47]。DAB组织定位操作比较简单，成本较小，结果明显，比较容易辨别，重复性强，但是容易受到人为操作的影响。

　　2.3综合鉴定法

　　植物抗寒性机理十分复杂，采用单一的指标难以反映其抗寒性本质[48-49]，因此在探究植物的耐低温性研究时，采用多个生理生化指标去衡量的综合鉴定法，可增强准确性，常运用到的分析方法有主成分分析法，隶属函数法和聚类分析法等。主成分分析法是将多个具有一定相关性的评价指标，通过计算转化成个数较少且代表性彼此独立的抗逆性综合评价指标，以减少各指标间原有的相关性，提高评价指标的可靠性。

　　3提高植物耐低温性的途径

　　3.1植物抗冻锻炼

　　将植物在非伤害性的零上低温条件下诱导其抗寒力逐渐增强的过程称之为抗寒锻炼，这个过程可以在人为设置的控制低温下进行，也可以在自然越冬条件下进行[62]。植物抗冻性是一个非常复杂的性状，包括抵抗低温对植物功能的直接影响和因冰晶形成造成的间接影响的能力。

　　经过抗冻锻炼的植物有一定水平的抗冻性，而未经过抗冻锻炼的植物在严重低温胁迫下将会死亡，抗冻锻炼程度与植物生长阶段以及冬季的休眠期密切相关，不同品种的植物抗冻性有区别[3]。逆境条件下，植物内源ABA含量也上升，叶片含水量下降，束缚水比例上升，气孔阻力及可溶性糖含量增加，植株体内的一些酶活性(POD、SOD、CAT、ATP酶)升高，特别是POD酶的活性有了极显著的提高[63]。

　　Kazuoka等发现，多种植物在低温锻炼期间，可溶性蛋白含量随低温锻炼过程抗寒性的提高而增加[64]。但是Uemura等得出不同的结论，即可溶性蛋白质含量在低温锻炼中并没有实质性的改变[65]。林善枝等发现，在不同低温锻炼期间，毛白杨幼苗总可溶性蛋白质含量增加，抗冻性增强，可溶性蛋白质含量的增加有助于加强细胞的保水力，提高细胞内的束缚水，降低冰点。用环己亚胺处理幼苗，可溶性蛋白含量随时间的延长而下降，植物的抗寒性变弱，这种低温处理的结果与逐渐缩短光照天数的结果是一致的[66]。

　　林善枝的研究结果与刘鸿等[67]、简令成等[68]的研究一致，在低温和短日照这2种特定条件下，植物这种潜在的抗冻基因才会表达，从而提高植物的抗冻力。笔者所在课题给研究发现10℃冷驯化10d引起被驯化马铃薯材料378个基因显著上调表达;692个基因显著下调，97个miRNA显著上调表达;21个miRNA显著下调(待发表)。

　　3.2外源生长调节剂的调控作用

　　植物外源生长调节剂是一种植物激素，在低浓度下对植物的生长发育起促进或者抑制的作用[69]。外源生长调节剂对植物耐低温性影响研究常在脱落酸(ABA)、多效唑(PP333)、油菜素内脂(BR)等中展开。外源生长调节剂的主要功能是诱导植物产生对不良生长环境的抗性。在寒冷胁迫下，脱落酸启动细胞抗冷基因的表达，诱导植物产生抗寒能力[70]。

　　在水稻[71]、番茄[72]、辣椒[73]等植物上都已经证实，抗寒性强的植物品种，其内源脱落酸含量高于抗寒性弱的品种，并且发现脱落酸可以减轻黄瓜、南瓜、水稻、柑橘的低温伤害[63]。在未来的农业和生产当中，作物化控技术作为农业生产的新技术，是传统农艺技术的发展与补充，也是高产优质高效生产技术的重要配套技术[70]。当前阶段，关于植物生长调节剂的应用是比较狭窄的，需要开发新的产品来与现代农业匹配，在今后的开发和创新过程中，品种种类多样、高效，以及多功能的混合制剂是主要方向。

　　3.3基因工程

　　基因工程一种是现代生物分子育种的技术手段。基因是编码遗传信息的基本遗传单位，基因工程育种具有高效、定向和不受植物世代影响等优点。基因工程育种与常规育种以及分子标记结合起来，加快了植物的育种进程。但由于植物基因工程是一个新兴研究领域，研究基础比较薄弱，还有许多问题有待进一步研究:

　　(1)转移多个基因的技术不成熟。植物的抗寒性是由多个复杂基因控制的，但抗寒基因工程大多是围绕单个基因研究。

　　(2)可利用的目的基因不多。植物的抗寒性受一个庞大的调控网络控制，涉及大量的基因，而目前分离的主要是一些保护类的基因，且多来自拟南芥等模式植物。要想植物的抗寒育种取得更大的突破，必须从不同的植物分离更多的基因，深入研究植物的抗寒分子机理。

　　(3)转基因的表达系统不完善。目前，抗寒基因工程多采用CaMV的35S组成型强启动子来启动外源基因在植物体内的组成型表达，虽在逆境下能较好地提高植物抗寒水平，但在非逆境下，这种不必要的高表达也给植物带来许多负面效应[74]。

　　利用基因工程的手段，将DREB转录因子和抗冻蛋白基因导入烟草、水稻、油菜等植物中，相信随着分子生物学技术和方法的不断发展，用基因工程方法提高农作物的抗寒性必将会取得可喜的进展，具有广泛的实际应用前景[75]。

　　4结束语

　　植物对低温的适应性受多基因调控，会产生复杂的生理生化反应，采用综合鉴定法，能比较准确地鉴定植物的抗寒性。在众多的抗寒性指标中，相对电导率的测定应用最为广泛，过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等研究的也颇多，在分析的过程中一般采用主成分分析法、隶属函数法和聚类分析法。

　　综合近几年的研究结果可以看出，植物低温响应机制研究重点已经从基本功能基因转向信号调控网路。转录因子处在低温信号响应的上游，在转录水平上主导着低温相关蛋白的级联反应，低温响应转录调控机制正被逐步阐明。

　　另外，miRNA介导的转录后基因调节网络在低温响应中的作用机制也被逐步揭开面纱，随着对于miRNA作用机制进一步深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技术手段对于信号转导中miRNA和靶基因之间的关系进行研究，将会使人们对于植物低温响应基因表达调控网络的理解提高到一个新的水平。

　　参考文献:

　　[1]王毅，杨宏福，李树德.园艺植物冷害和抗冷性的研究(综述)[J].园艺学报，1994，21(3):239-244.

　　[2]乌凤章，王贺新，徐国辉，等.木本植物低温胁迫生理及分子机制研究进展[J].林业科学，2015，51(7):116-128.

　　[3]许英，陈建华，朱爱国，等.低温胁迫下植物响应机理的研究进展[J].中国麻业科学，2015，37(1):40-49.

　　[4]李文明，辛建攀，魏驰宇，等.植物抗寒性研究进展[J].江苏农业科学，2017，45(12):6-11.

　　[5]杨宁宁，孙万仓，刘自刚，等.北方冬油菜抗寒性的形态与生理机制[J].中国农业科学，2014，47(3):452-461.

　　[6]宋尚伟，刘程宏，张芳明，等.不同石榴品种抗寒性的研究[J].河南农业大学学报，2012，46(2):143-146.

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