外源一氧化氮对低温胁迫下茶树幼苗生理特性的影响

　　摘要：为探究外源一氧化氮(Nitricoxide，NO)供体硝普钠(Sodiumnitroprusside，SNP)对低温胁迫下茶树幼苗的缓解作用，采用人工气候室模拟低温胁迫试验，研究了叶面喷施不同浓度SNP对低温胁迫下两年生碧香早茶苗叶片膜脂过氧化程度、渗透调节物质含量及抗氧化酶活性的影响。

　　结果表明，适宜SNP浓度可降低低温胁迫下茶树叶片相对电导率，抑制丙二醛含量的升高，促进脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的大量积累，提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，从而缓解低温胁迫对茶树叶片的伤害。试验结果表明，喷施浓度为200μmol·L-1的SNP效果最佳。

　　关键词：茶树;低温胁迫;外源NO;硝普钠;生理特性

　　茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]是一种喜温畏寒的多年生常绿木本植物。低温是茶树栽培过程中常遇的非生物胁迫之一，已成为限制茶产业健康发展的重要因素[1]。在生产中，早春茶园易遭受低温冷害或气温回暖后的“倒春寒”危害，使茶树生理代谢出现絮乱，严重时导致茶叶产量和品质下降。大量研究表明，茶树抗寒性与体内丙二醛(MDA)、可溶性糖、可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性等密切相关[2-3]。

　　抗寒性较强的茶树体内可溶性糖含量较高，可溶性蛋白含量积累增多[4-5]，SOD、CAT活性维持较高水平，SOD同工酶总活性及谱带数量明显增强[5-7]。因此，研究茶树对低温胁迫的响应机理，探索茶树抵抗低温和冷害具有重要意义。

　　一氧化氮(Nitricoxide，NO)作为生物体内重要的信号分子，对植物抗逆防御起重要的信号调节作用[8]，目前关于NO参与植物逆境胁迫的应答反应已成为研究热点。Tian等[9]研究发现，外源NO能诱导干旱胁迫下小麦叶片气孔关闭而减少水分的损失，提高叶片中SOD、CAT活性，降低MDA和H2O2含量。

　　Zheng等[10]研究报道了外源NO能促进高盐胁迫下小麦种子萌发，增强小麦叶片中SOD、CAT活性和脯氨酸含量，降低细胞膜通透性，抵抗对叶片中线粒体氧化的伤害。Liu等[11]研究表明，外源NO可以提高低温胁迫下黄瓜幼苗体内的保护酶活性，从而增强植株对低温胁迫的适应性。陈银萍等[12]研究表明，低温胁迫下不同浓度硝普钠(SNP)能显著提高玉米种子的发芽率，抑制叶片MDA含量的升高，降低叶片质膜相对透性，增加相对含水量、脯氨酸含量和叶绿素含量。

　　外源NO针对禾本科、豆科、蔬菜和林木等植物在水分、盐度、温度等非生物胁迫的研究较多，但关于逆境胁迫下NO介导的茶树生理反应研究较少，尤其是NO对于低温胁迫下茶树生理特性的影响尚未深入研究。因此，本研究通过对碧香早茶苗叶面喷施外源NO供体SNP，探讨不同浓度SNP对低温胁迫下茶树主要生理指标的影响，以期筛选出提高茶苗抗低温能力的适宜SNP浓度，为进一步深入研究外源NO提高茶树幼苗抵抗低温冷害等非生物胁迫能力提供理论参考。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　供试材料为湖南省茶叶研究所高桥基地提供的两年生碧香早茶树盆栽苗。选择长势基本一致的茶苗移栽于盆口直径为30cm的聚乙烯盆中，每盆种植3株，培养土为70%茶园土混以30%有机肥料，定期浇水。试验在湖南农业大学茶学教育部重点实验室进行，温室内温度控制在20~25℃，相对湿度60%~75%，缓苗3个月。试验所用NO供体SNP[Na2Fe(CN)5]纯度为98.5%，购自上海生工生物有限公司。先将其配制成100mmol·L-1母液，4℃保存，用时按所需浓度稀释。

　　1.2试验方法

　　1.2.1试验设计

　　选取大小和长势一致，生长健壮且无病虫、伤残叶的盆栽茶苗，移至人工智能气候箱培养，箱内温度控制在(25±1)℃，相对湿度保持在(60±5)%，光照周期为12h·d-1，培养3d。3d后对幼苗进行叶面喷施处理，每次定量喷施250mL，均匀喷施至叶片正反面水珠欲滴为止，1d喷1次，连续喷施3d。

　　试验共设4个处理：(1)–2℃低温胁迫+清水处理(CK);(2)–2℃低温胁迫+200μmol·L-1SNP(C1);(3)–2℃低温胁迫+500μmol·L-1SNP(C2);(4)–2℃低温胁迫+1000μmol·L-1SNP(C3)。每处理重复3次，每个重复15株苗。

　　1.2.2低温处理

　　将已喷施的茶苗移至–2℃的人工气候培养箱进行低温处理，光照周期设为12h·d-1，相对湿度(60±5)%。分别于低温胁迫的第0、6、24、48h和72h时进行取样，取第1片成熟叶片测定电导率，取一芽二叶测定各项生理指标，立即装入封口袋内，迅速放入液氮中速冻，保存至–70℃冰箱备用。

　　1.3测定项目与方法

　　采用电导法测定相对电导率[13];采用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量[14];采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[15];采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量[15];采用茚三酮显色法测定脯氨酸含量[15-16];采用氮蓝四唑(NBT)显色法测定SOD活性[17];采用H2O2紫外吸收法测定CAT活性[16]。

　　1.4数据处理

　　采用MicrosoftExcel2010软件进行数据处理，SPSS17.0统计分析软件进行方差分析和差异显著性分析，多重比较采用Duncan法。

　　2结果与分析

　　2.1对低温胁迫下茶树叶片相对电导率的影响

　　随着低温胁迫时间延长，茶树叶片相对电导率整体上升，不同处理间波动较大，均在72h时达到峰值。低温胁迫过程中，茶树叶片相对电导率以200μmol·L-1SNP(C1)最低，6、24、48、72h时较清水处理(CK)分别显著降低36.07%、43.80%、13.37%和27.94%(P<0.05)。

　　500μmol·L-1SNP(C2)在48h前均显著高于CK;72h时低于CK，较CK显著降低7.16%(P<0.05)。1000μmol·L-1SNP(C3)在24~72h时间段均高于CK，较CK显著增加2.34%~5.18%(P<0.05)，这表明高浓度SNP对降低茶树幼苗低温胁迫下叶片电导率无明显的促进作用。

　　2.2对低温胁迫下茶树叶片MDA含量的影响

　　低温促使茶树叶片产生MDA，并随低温胁迫时间延长而逐渐升高，72h时叶片MDA含量达到峰值。低温胁迫下，外源NO可明显降低叶片中MDA含量，并随着胁迫时间的延长不同SNP浓度对降低叶片MDA含量的效果也存在一定差异。

　　C1处理的茶树叶片MDA含量在48h和72h时较CK分别显著降低了15.16%和39.81%(P<0.05)，C2和C3处理在6~72h时分别显著降低了14.24%~26.31%和11.86%~27.76%(P<0.05)。说明低浓度SNP处理对抑制低温胁迫下茶树叶片MDA含量升高的效果更好。

　　2.3对低温胁迫下茶树叶片脯氨酸含量的影响

　　随着低温胁迫时间延长，茶树叶片脯氨酸含量呈上升趋势。低温胁迫下喷施不同浓度SNP的叶片脯氨酸含量均高于CK，并在72h时达到峰值，其中C1处理最高，显著高于C2和C3处理。

　　与CK处理相比，C1处理的脯氨酸含量在低温胁迫6、24、48、72h时分别显著增加24.54%、28.05%、43.67%和66.67%(P<0.05)，C2处理在低温胁迫24~72h时分别显著增加9.84%~49.68%(P<0.05)，C3处理在低温胁迫48h和72h时分别显著增加9.02%和35.74%(P<0.05)，说明低浓度SNP对增加低温胁迫下茶树叶片脯氨酸含量的效果显著。

　　2.4对低温胁迫下茶树叶片可溶性蛋白含量的影响

　　茶树叶片在低温胁迫过程中可溶性蛋白含量均呈上升趋势，喷施SNP处理的可溶性蛋白含量均显著高于CK(P<0.05)，72h时均达到最高值，其中C1处理最高，显著高于C2和C3处理。较CK处理，C1处理的可溶性蛋白含量在低温胁迫6、24、48h和72h时分别显著增加51.73%、51.72%、42.62%和32.94%(P<0.05)，C2和C3处理在低温胁迫6~72h时分别显著增加9.92%~40.68%和28.93%~44.03%(P<0.05)，C2和C3处理对增加低温胁迫下茶树叶片可溶性蛋白含量的累积效果较C1处理差。

　　2.5对低温胁迫下茶树叶片可溶性糖含量的影响

　　低温胁迫使茶树叶片的可溶性糖含量不同程度的增加，72h时达到最高值，不同浓度SNP处理的茶树叶片可溶性糖含量的变化趋势与可溶性蛋白基本一致。C1处理在低温处理各时段均最高，显著高于其他处理，低温胁迫6、24、48h和72h时C1处理较CK分别显著增加18.91%、12.57%、28.03%和33.20%(P<0.05);C2和C3处理在低温胁迫6~72h时较CK分别显著增加3.06%~19.89%和2.73%~18.11%(P<0.05)。

　　2.6对低温胁迫下茶树叶片CAT活性的影响

　　低温胁迫下茶树叶片CAT活性呈先上升再下降的趋势，SNP处理的叶片CAT活性波动较大，CK在0~6h间CAT活性有所下降，24h时显著增加，之后下降。C1处理在0~6h时CAT活性变化较小，6~24h活性显著增强，之后有所下降，整个低温胁迫过程中CAT活性以C1处理最高，在6、24、48、72h时较CK处理分别显著增加53.06%、100.00%、49.66%和59.43%(P<0.05);C2处理的CAT活性仅高于CK，低温胁迫过程中与CK处理差异不显著;C3处理的CAT活性在6~72h时较CK显著增加了43.09%~64.88%(P<0.05)，但较C1处理效果差。

　　2.7对低温胁迫下茶树叶片SOD活性的影响

　　低温胁迫过程中，茶树叶片SOD活性总体呈先上升后下降的趋势，24h时SOD活性达到峰值。喷施不同浓度SNP能不同程度提高茶树叶片的SOD活性，且显著高于CK(P<0.05)。

　　低温胁迫过程中SOD活性以C1处理最高，在6、24、48h和72h时C1处理较CK在分别显著增加9.79%、14.81%、23.29%和19.43%(P<0.05);C2和C3处理间差异较小，C2处理在低温胁迫24~72h时和C3处理在低温胁迫48~72h时较CK分别显著增加10.37%~17.81%和6.64%~12.33%(P<0.05)。

　　3讨论

　　细胞膜是植物感受低温伤害的主要部位，低温使细胞膜透性增大，细胞内电解质外渗，从而导致细胞受到损害。研究表明，适宜SNP浓度能够显著降低植物幼苗在低温胁迫下质膜相对透性，显著抑制MDA的积累，从而提高植物幼苗对低温胁迫的适应性[18-19]。本试验结果显示，外源NO显著抑制了茶树叶片中MDA含量的积累，降低了叶片相对电导率，这与徐洪雷[18]和樊怀福等[20]的研究结果一致。

　　可能是低温促进了H2O2和O2-的积累，进而激发了MDA的产生，对茶树叶片的细胞膜结构造成了破坏，而NO作为信号分子减少了膜质过氧化产物MDA的积累，在一定程度上保护了低温胁迫下叶片细胞质膜的结构，缓解了细胞膜质过氧化作用带来的损伤。然而，NO在植物体中的作用具有二元性：低浓度的NO对植物体具有一定的保护作用，而高浓度NO则会严重伤害植物组织和细胞[21]。

　　即本研究结果中，200μmol·L-1的SNP处理可以有效降低低温胁迫下茶树叶片的相对电导率和抑制MDA含量的升高，而SNP浓度升高，其作用效果减弱。逆境胁迫会直接或间接引起植物细胞内渗透势的变化造成细胞质脱水，而植物通过短时间内迅速积累渗透物质进行渗透调节的方式来适应逆境。可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸都是植物体内重要的渗透调节物质，它们可消除低温胁迫产生的毒性物质，从而减少因水分流失引起的冰晶形成[22]。

　　本研究中，外源NO可显著提高低温胁迫下茶树叶片脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量，与Zhao等[23]、Liu等[11]、吴旭红等[24]和郭经纬等[25]的研究结果一致。由此推测，低温胁迫导致细胞结构遭到破坏，而NO通过质外体直接作用于细胞壁的组分，促进细胞内水分从根系向叶片运送，从而增强细胞膜的稳定性，减少电解质外渗。过高浓度的SNP会影响渗透调节物质增加的效果，可能是由于高浓度的NO可以与O2-作用产生过氧亚硝酸，导致细胞膜受损，渗透调节失衡，从而导致植物受到更严重的伤害[21]。

　　NO是参与植物生理过程中的信号传导分子，它在植物生长和发育中起着至关重要的作用，其信号系统可以诱导和激活植物抗氧化系统。研究表明，SNP可以明显提高多种作物中CAT、POD、SOD等酶的活性，并提高作物在遭受低温逆境后的成活率[26-27]，这与本试验结果一致。

　　由此推测可能是NO与含铁的CAT等相关酶类具有很强的亲和性，能够调节含血红素铁的酶类活性，并抑制含非血红素铁的顺乌头酸酶等靶酶的活性[28]。SOD活性的提高可能是在低温胁迫下NO作为信号分子来诱导SOD编码基因的表达[29]。适当浓度的SNP处理能够提高SOD和CAT等抗氧化酶的活性，有效清除低温胁迫引起的植物体内积累的活性氧，提高低温耐受性的能力，减轻低温胁迫对植物的伤害。

　　4结论

　　低温胁迫下茶树叶片的相对电导率和MDA含量明显升高，脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量显著增加，SOD和CAT的活性升高。外源NO处理显著降低了低温胁迫下茶树幼苗叶片的相对电导率，抑制了MDA含量升高，进一步促进了脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的积累，显著提高了抗氧化酶(SOD、CAT)的活性，从而增强了茶树幼苗抵抗低温胁迫的能力。综上所述，低温胁迫下，外源NO供体SNP浓度为200μmol·L-1处理碧香早茶树品种缓解效果最好，而较高SNP浓度对其缓解作用较差。

　　参考文献

　　[1]周琳,陈暄,王玉花,等.超敏蛋白对低温胁迫下茶树生理特性的影响[J].园艺学报,2014,41(4):746-754.

　　[2]林郑和,钟秋生,陈常颂.茶树抗性育种研究进展[J].福建茶叶,2015,37(4):2-4.

　　[3]杨再强,韩冬,王学林,等.寒潮过程中4个茶树品种光合特性和保护酶活性变化及品种间差异[J].生态学报,2016,36(3):629-641.

　　[4]粟本文.茶树抗寒性研究概况[J].茶叶科学简报,1991(4):27-29.

　　农业幼苗论文投稿刊物：《园艺学报》是中国园艺学会主办的学术性期刊，刊登果树、蔬菜、西瓜甜瓜和观赏植物等方面示曾发表过的学术论文、研究报告、研究简报、专题文献、综述，经过审定或鉴定的新品种、新书介绍、学术活动信息等。