外源氯化钙对低温胁迫下胡椒抗寒生理指标的影响

　　摘要以中国胡椒主栽品种热引1号胡椒为材料，设置4个不同浓度氯化钙(7、14、21、28mmol/L)处理，以去离子水为对照，低温胁迫4d(10℃/5℃，12h/12h)，恢复培养6d(28℃/20℃，12h/12h)，观察表型并测定各处理的光合参数、抗氧化酶活性及渗透性物质含量变化情况。

　　结果表明：7mmol/L氯化钙处理胡椒可以改善寒害表型，随氯化钙浓度升高寒害表型逐渐加重;外施7mmol/L氯化钙能够显著改善胡椒的净光合速率，随氯化钙浓度升高，净光合速率越来越低，氯化钙浓度过高时(达到28mmol/L)净光合速率低于CK;与CK相比，外施7mmol/L氯化钙能够显著提高抗氧化酶活性、增加可溶性糖含量、降低丙二醛含量，随处理浓度升高，抗氧化酶活性和可溶性糖含量越来越低，丙二醛含量越来越高。本研究结果为胡椒生产上抗寒技术指导和抗寒分子育种提供了参考。

　　关键词热引1号胡椒;氯化钙;低温胁迫

　　胡椒(Pipernigurm)是胡椒属(Piper)多年生常绿藤本植物，素有“香料之王”的美誉，是世界最重要的香辛料作物[1]。中国胡椒主要分布在海南、云南、广东、广西和福建等省(区)，种植面积近3万公顷，年产约3.60万吨，居世界第五[2]。随着人们生活水平提高，现在国内胡椒年消费量以20%速度上涨，供需矛盾更加突出。近年来，由于胡椒种植综合效益高、发展前景好，政府和百姓种植胡椒积极性很高，云南、广西等省区胡椒种植面积发展迅速[3-4]。

　　栽培种胡椒起源并长期种植于热带、南亚热带地区，抗寒能力较弱。通过多年田间调查和生理生化指标测定，在栽培胡椒种内未鉴定出抗寒种质。由于我国热区纬度偏高，寒流等极端气候频发，胡椒易遭受寒害，出现掉叶、断枝现象，伤口又进一步引发病害感染，对胡椒生产造成严重影响。生产上胡椒防寒措施主要有越冬前设防风帐或放熏烟堆，寒害后剪除枯枝、喷药杀菌等，但是这些措施效果有限，灾后补救难以减少椒农损失[5-6]。

　　因此，研究如何提高胡椒抗寒性，可为实现胡椒安全越冬、稳定胡椒产业发展奠定基础。钙在植物生长过程中起着不可或缺的作用[7]。钙作为一种信号物质参与细胞内外各种生理活动[8]，具有感知外界环境胁迫和维持细胞膜完整性和选择性的作用[9]。当植物感知外界环境变化时，细胞内Ca2+浓度会发生特定变化，并引发一系列保护性生理反应[10]。已有研究表明，Ca2+在植物对酸、有毒金属、干旱、寒冷等适应中发挥着积极作用[11-12]。

　　适量的钙可以缓解外界胁迫的负面影响。在盐胁迫下，外源钙能维持细胞外形促使香蕉幼苗叶片正常，使盐胁迫伤害得到缓解[13]。在4℃低温胁迫条件下，外源钙处理狗牙根中H2O2、O2-和MDA含量显著低于对照[14]。Zhang等[15]研究发现氯化钙预处理番茄可以减轻夜间低温对其的光抑制作用。

　　冀乙萌[16]等研究发现，20mmol/L外源Ca2+处理的木薯幼苗膜伤害率、丙二醛含量降低，SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯胺酸寒含量上升，抗寒性提高效果较明显，Ca2+浓度过高不利于其抗寒性增强。然而，钙在胡椒对低温胁迫反应中的作用还不清楚，钙是否能减轻低温对胡椒的危害值得研究。

　　本研究通过不同浓度氯化钙溶液对低温胁迫下胡椒抗寒表型和生理指标变化的研究，总结不同Ca2+浓度对胡椒抗寒性的影响，筛选能够提高胡椒抗寒性的适宜氯化钙浓度，为今后胡椒抗寒驯化研究和生产应用提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　供试材料为我国主栽品种热引1号胡椒(Pipernigrumc.v.Reyin-1)，保存于中国热带农业科学院香料饮料研究所“农业农村部万宁胡椒种质资源圃”。热引1号胡椒插条苗按照农业行业标准“胡椒插条苗”(NY/T360-1999)培育，选取生长正常、无病虫害和机械损伤的插条，在温室沙床中培育生根，生根后转移至育苗袋中抚育3个月，转移至人工气候室中进行低温处理。

　　1.2方法

　　1.2.1试验设计

　　将供试材料在人工气候室中培养(28℃/20℃，12h/12h，相对湿度保持在70%左右)，分别设置7mmol/L(T1)、14mmol/L(T2)、21mmol/L(T3)和28mmol/L(T4)4个氯化钙浓度梯度，以去离子水为对照(CK)，每个处理4株，3次重复。

　　将不同浓度氯化钙溶液喷施在植株正反两面叶片上，以滴水为准，剩余溶液灌溉在植株根部，每隔1天喷施1次，共3次。依据王灿等[3]对胡椒寒害气候等级研究、云南省绿春县冬季低温寒潮常出现的低温情况和吴雪霞[17]等对低温胁迫及恢复对茄子幼苗的影响，本研究采用的低温胁迫条件为10℃/5℃(12h/12h)胁迫4天，并恢复培养6天(28℃/20℃，12h/12h)。观察表型，采集叶片并置于液氮中迅速冷冻，-80℃保存用于测定叶片生理生化变化。

　　利用Li6400型便携式光合仪分别于氯化钙处理完成和恢复培养完成时测量植株光合参数(净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Tr)、蒸腾速率(Ci))。测定时间为光照培养5h以后，CO2浓度为(385±5)μmol/mol，测定光强为600μmol/(m2·s)，采用标准叶室，开放式气路，流速均设定为500μmol/s。

　　1.2.2测定方法

　　采用江苏科铭生物技术有限公司测定试剂盒分别测定可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、POD、CAT、SOD酶活性、丙二醛含量、脯氨酸含量等生理生化指标，按照说明书操作实验和计算，每个样品测定3次重复。

　　1.2.3数据分析

　　所采集数据取3次重复的均值，用SPSS统计分析软件进行数据分析，多重比较采用Duncan新复极差法，在0.05水平比较差异显著性。

　　2结果与分析

　　2.1不同浓度氯化钙对低温胁迫下胡椒植株表型的影响

　　通过观察不同浓度氯化钙对低温胁迫下热引1号胡椒表型发现，T1、T2和T3处理植株受害较轻，T1处理植株几乎没有寒害表型，T2和T3处理植株部分叶片发黄，稳定叶叶尖有不同程度发黑现象，T4处理植株受害较重，植株表现为嫩叶发黑脱落，部分稳定叶发黄发黑并脱落。CK处理植株受害最为严重，植株表现为嫩叶发黑脱落，稳定叶发黑最为严重，大部分发黑叶片脱落。说明一定浓度氯化钙处理可以缓解胡椒寒害表型，以7mmol/L氯化钙处理胡椒寒害表型最轻。

　　2.2不同浓度氯化钙对低温胁迫下胡椒叶片光合参数的影响

　　低温胁迫前，T1与T2处理的胡椒叶片光合参数与CK无显著差异;与CK相比较，T3处理中胡椒叶片中净光合速率有显著降低(13.51%)，而气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率无显著降低;T4处理中胡椒叶片中净光合速率显著降低了72.97%，且气孔导度和蒸腾速率也分别显著降低了83.33%和71.43%。

　　以上结果说明，常温条件下，外施7mmol/L和14mmol/L氯化钙溶液对胡椒的光合参数没有影响，高浓度氯化钙(高于14mmol/L)处理会抑制显著胡椒净光合速率、气孔导度及蒸腾速率。

　　低温胁迫条件下，与CK相比，T2和T3处理的胡椒光合参数无明显差异;T4处理的净光合速率显著降低了93.08%，胞间CO2浓度显著提高了18.41%;T1处理的净光合速率显著提高了78.21%，胞间CO2浓度显著降低了5.56%;以上结果说明，外施不同浓度的氯化钙对低温胁迫条件下胡椒的光合参数有不同的影响，外施7mmol/L氯化钙能够显著提高低温胁迫条件下胡椒的净光合速率，外施28mmol/L氯化钙显著降低了低温胁迫条件下胡椒的净光合速率。

　　2.3不同浓度氯化钙对低温胁迫下胡椒叶片中Ca2+-ATPase活性的影响

　　细胞受到逆境刺激可导致胞质内Ca2+水平升高，而Ca2+-ATPase可将Ca2+泵出细胞外或钙库中，使细胞中的Ca2+维持一定的水平，从而维持细胞正常新陈代谢。胡椒叶片中Ca2+-ATPase酶活性的影响。随外源钙浓度的增加，Ca2+-ATPase酶活性呈现先增加后减少的趋势。

　　与CK相比，T1和T2处理胡椒叶片中Ca2+-ATPase酶活性分别升高52.06%，46.84%，T4处理胡椒叶片中Ca2+-ATPase酶活性降低了14.17%，均无显著性差异，说明不同浓度的外源钙没有显著性改变胡椒叶片中Ca2+-ATPase酶活性，但是喷施7mmol/L和14mmol/L氯化钙可以一定程度提高胡椒叶片中Ca2+-ATPase酶活性。

　　2.4不同浓度氯化钙对低温胁迫下胡椒叶片SOD、CAT、POD活性的影响

　　不同浓度氯化钙处理对低温胁迫条件下胡椒叶片中SOD、CAT、POD活性具有不同的影响，随外源钙浓度增加，3种酶活性都呈现先升高后降低的趋势。与CK相比，T1和T2处理胡椒叶片中SOD活性都显著性升高了1.56和0.19倍，T3处理胡椒的SOD活性与CK没有显著性差异，T4处理使胡椒的SOD活性显著降低了27.10%。

　　说明喷施一定浓度的氯化钙(7mmol/L和14mmol/L)可以显著提高低温胁迫条件下胡椒的SOD活性，钙离子浓度增高(28mmol/L)会显著抑制低温胁迫条件下胡椒的SOD活性。与CK相比，T1处理胡椒叶片中CAT活性显著性升高了47.58%，其他浓度氯化钙处理的胡椒中CAT活性显著降低或没有显著性变化。

　　说明喷施7mmol/L氯化钙可以显著提高低温胁迫条件下胡椒的CAT活性，而增加氯化钙浓度不能提高。与CK相比，T1、T2、T3和T4处理都可以显著提高低温胁迫条件下胡椒叶片中POD活性，分别升高了25.62%、35.51%、25.40%和5.97%，其中T2处理提升效果最明显，其次是T1和T3。综合以上结果说明，喷施不同浓度的氯化钙可以改变SOD、CAT、POD活性，其中喷施7mmol/L氯化钙提高抗氧化酶活性效果最好。

　　2.5不同浓度氯化钙对低温胁迫下胡椒叶片淀粉、可溶性糖含量影响

　　随外源钙浓度的增加，胡椒叶片中可溶性糖含量呈现先增加后减少再增加的趋势，淀粉含量呈现先减少后增加的趋势。与CK相比，T2和T3处理胡椒中可溶性糖含量没有显著性变化，T1和T4处理能够使胡椒叶片中可溶性糖含量显著性增加，分别增加了26.03%和27.46%，说明7mmol/L和28mmol/L氯化钙处理胡椒可以提高可溶性糖含量。

　　与CK相比，T1处理的胡椒中淀粉含量显著降低(26.06%)，T2和T3处理的胡椒中淀粉含量无显著性差异，而T4处理胡椒中淀粉含量显著增加(13.39%)，说明7mmol/L氯化钙处理胡椒可以降低淀粉含量，而高浓度氯化钙(28mmol/L)可以提高淀粉含量。

　　2.6不同浓度氯化钙对低温胁迫下胡椒叶片丙二醛、脯氨酸含量影响

　　随外源钙浓度的增加，胡椒叶片中MDA含量呈现先减少后增加的趋势，游离脯氨酸含量呈现先增加后减少的趋势。与CK相比，T1和T2处理胡椒叶片中MDA含量显著性减少，分别减少了12.40%和11.39%，T3和T4处理胡椒叶片中MDA含量无显著性差异。说明低温胁迫下，7mmol/L和14mmol/L氯化钙处理胡椒可以减低丙二醛含量，而21mmol/L和28mmol/L氯化钙处理胡椒中无明显影响。

　　与CK相比，T1和T2处理胡椒叶片中游离脯氨酸含量均显著性增加，分别增加了25.87%和11.05%，T3和T4处理胡椒叶片中游离脯氨酸含量均显著性减少，分别减少了18.41%与30.38%。说明低温胁迫下7mmol/L和14mmol/L氯化钙处理胡椒可以提高脯氨酸含量，21mmol/L和28mmol/L氯化钙处理胡椒降低了脯氨酸含量。

　　3讨论

　　分析云南和海南胡椒主产区寒潮天气情况发现，云南主产区冬季经常出现低温3℃-6℃、高温10℃-15℃持续2-4天的寒潮，海南主产区部分年份也会出现类似寒潮(如2016年1月);胡椒在寒潮过后几天内陆续出现寒害症状，通过预实验也发现低温胁迫后恢复培养4-6天植株寒害症状最明显。

　　因此本试验在低温胁迫后恢复培养了6天才取样测定生理指标。伍宝朵等[18]通过不同温度(4℃、6℃、8℃、10℃、CK)处理热引1号胡椒发现，胁迫72h后不同温度处理均有寒害表型，随温度的降低，植株寒害程度逐渐加剧;不同温度处理POD、CAT、SOD活性均显著高于CK，10℃胁迫时可溶性蛋白和可溶性糖含量显著高于其他处理，胁迫温度达到4℃时，丙二醛和脯氨酸含量才显著高于CK。

　　以上可以作为评价胡椒抗寒重要生理指标。此外，钙不仅作为植物的必需营养元素成为植物细胞的物质组成，而且还是胞外信号和胞内生理反应偶联的第二信使，可以维持细胞膜的稳定性，在植物生长发育及环境胁迫响应中起着重要作用[10,19]。研究表明，在低温胁迫下，适宜浓度钙可以提高植物光合作用、保护酶系统活性等，提高植物抗寒能力[15-16]。

　　因此探讨外源钙对低温胁迫条件下胡椒光合作用及保护酶活性等生理指标的影响可为胡椒抗寒研究提供参考。光合作用是植物利用光能转化为化学能，进行同化作用的重要生理过程，也是受低温影响最显著的生理过程之一[20-22]。植物净光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度及蒸腾速率是光合特性重要参数[23-24]。蒲玉瑾等[25]研究发现，常温条件下，不同浓度外源Ca2+对降香黄檀叶长净光合速率、气孔导度、蒸腾速率均有显著影响。

　　本研究中，常温条件下，T1和T2处理胡椒叶片光合作用与对照比没有显著变化，当浓度高于21mmol/L时，随浓度增加，净光合速率逐渐降低。这与朱晓军等[26]、张浩[27]等的研究结论一致。研究表明低温会引起植物净光合速率、气孔导度、蒸腾速率同时降低，其中最明显的就是净光合速率降低[28]，在净光合速率降低时，如果胞间CO2浓度也同时降低，说明是因气孔因素引起了光合作用[29]。

　　如果胞间CO2浓度升高，则说明可能是由光化学活性或RuBP羧化限制等非气孔因素阻碍CO2的利用，造成CO2积累[30]。同时Ahmad[31]和He[32]等研究表明，外源钙常通过调节叶片碳同化能力减轻环境胁迫对光合作用的抑制能力。本研究低温胁迫后，不同氯化钙浓度处理胡椒的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率较胁迫前有明显的降低，与CK相比较，T1处理净光合速率显著升高，说明一定浓度外源钙可以减轻低温胁迫对胡椒光合作用的抑制能力。

　　各处理胞间CO2浓度显著增高，说明低温胁迫下胡椒叶片净光合速率的下降可能是由非气孔因素引起的。外源钙对胡椒叶片碳同化能力的影响值得进一步研究。Ca2+浓度变化依赖于质膜或细胞器膜上的Ca2+转运系统，膜Ca2+转运系统活跃程度对细胞内Ca2+浓度变化有重要影响。赵明明等[33]研究表明低温胁迫48h后，抗寒性强的冬青Ca2+沉淀较少，抗寒性弱的冬青Ca2+沉淀较多，细胞器破坏也严重。

　　因为细胞内Ca2+的升高是短暂的，完成信使作用后即会撤退，滞留在细胞内会造成Ca2+毒害。本研究中各处理间Ca2+-ATPase活性没有显著差异，但是与CK相比，T1和T2处理分别升高了52.06%和46.84%，说明低温胁迫后，7mmol/L和14mmol/L氯化钙处理胡椒中出现了短暂的Ca2+升高，为了促使Ca2+及时撤退，Ca2+-ATPase活性升高;T3和T4处理Ca2+-ATPase活性没有上升或有少量下降，原因可能是外施氯化钙浓度过高，细胞内Ca2+沉淀较多，对细胞产生了毒害作用。这一观点需要进一步细胞学实验验证。

　　环境胁迫条件下，Ca2+可以激活植物抗氧化途径，提高抗氧化酶活性，增强保护酶系统清除自由基和活性氧的能力，减轻膜脂的过氧化程度，降低MDA含量[34]。外源5mmol/LCa能够显著抑制镉胁迫下苎麻中H2O2和丙二醛含量、增加超氧化物歧化酶活性及植物干重，显著减轻苎麻中镉毒性积累[35]。外源施用Ca有利于优化番茄植株的矿质营养状况，使番茄植株具有良好的抗氧化能力和耐盐能力[36]。

　　冀乙萌等[16]发现20mmol/LCa2+浓度处理木薯低温胁迫下MDA含量最少，保护酶SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸含量最多。本研究通过不同浓度氯化钙处理对低温胁迫条件下胡椒叶片中抗氧化酶活性影响比较发现，低温胁迫下，外施不同浓度氯化钙可以改变抗氧化酶活性。与CK相比，T1处理能够显著提高3种抗氧化酶活性、增加可溶性糖含量、降低丙二醛含量，随外源钙浓度升高，3种抗氧化酶活性和脯氨酸含量越来越低，丙二醛含量越来越高。说明外施7mmol/L氯化钙激活了胡椒的抗氧化途径，促使抗氧化酶活性升高，提高了低温胁迫下细胞清除自由基和活性氧的能力，减轻了膜脂过氧化程度，增强了细胞的渗透势，降低了MDA含量。

　　在植物组织器官中，淀粉可以被降解形成可溶性糖，参与细胞内的生理生化反应。本研究中T1处理淀粉含量显著低于其他处理，说明在该处理条件下，淀粉可能被分解成可溶性糖，引起本处理可溶性糖含量的增加。令人疑惑的是，在本研究中发现，T4处理淀粉和可溶性糖含量都显著高于其他处理，但是除CK外，本处理植株寒害表型最严重，这一问题需要进一步的实验验证和研究。

　　本研究还发现增加氯化钙处理浓度并不能改善胡椒抗寒表型及相关指标，原因可能是因低温胁迫引起了质膜或钙库膜钙离子通道的开启，大量Ca2+进入胞内，依赖于Ca2+或Ca2+-CaM蛋白激酶或磷酸脂酶被激活，导致细胞骨架蛋白和膜蛋白的磷酸化及膜脂降解，造成细胞骨架与膜结构受到破坏;另外大量Ca2+在细胞核内密集分布也会破坏遗传物质的合成及表达[37]。

　　因此，下一步应开展Ca2+在细胞内沉淀分析实验进行验证。关于外源Ca2+能够缓解环境胁迫对植物的伤害报道较多，但是不同植物适宜外源Ca2+处理浓度大不相同。外源2mmol/LCa2+可增加南方菟丝子寄生的喜旱莲子草茎维管束数目，降低茎的节间长、厚角厚度与皮层厚度[38]，而外源60mmol/LCa2+对提高万寿菊抗寒性效果最佳[39]。

　　在本试验中，综合表型和生理指标结果得出，外施7mmol/L氯化钙是提高胡椒抗寒性的适宜浓度。因此，适宜胡椒Ca2+施用浓度的筛选为生产上增强胡椒低温抵御能力提供了参考，对促进胡椒在我国适宜种植区的推广种植及稳产具有重要的意义。

　　参考文献

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