梅种质资源与分子生物学研究进展

　　摘要:梅起源于我国，具有丰富的种质资源和遗传多样性。国家级种质资源圃的建立提高了梅种质资源的保存与鉴定水平，同时梅基因组测序的完成也促进了近年来梅分子生物学研究。本文重点综述了梅的起源与分布、资源收集与鉴定评价、核基因组与叶绿体基因组研究、雌蕊发育机制、自交不亲和机制、季节性休眠机制、分子标记、组织培养及遗传转化等方面的研究进展，探讨了梅种质资源研究和分子生物学研究中存在的问题，并指出了今后的重点研究方向。

　　关键词:梅;种质资源;分子生物学

　　梅(PrunusmumeSieb.etZucc.)原产于中国，为蔷薇科李属植物。梅种质资源丰富，遗传多样性广泛，与核果类果树杏、李、樱桃和桃均可进行种间杂交。梅果实具有较高的营养价值，其经济栽培主要分布在东亚和东南亚的亚热带地区，中国是目前梅种植面积最大的国家。根据用途，梅可分为果梅和花梅2种类型。2011年国家果梅种质资源圃的建立和2012年基因组测序的完成，促进了梅种质资源的收集、保存、评价利用以及分子生物学的发展。近年来，国内外学者在梅资源鉴定和分子生物学研究等方面取得了较大的进展，本文对近20年梅种质资源评价鉴定和分子生物学研究等方面进行全面综述，为今后梅的科学研究提供借鉴和参考。

　　1梅起源分布与资源研究

　　1.1梅的起源和分布

　　一般认为梅栽培历史有3000多年[1]，但据近年在我国河南省发现的梅核化石分析认为，在距今7000～7500年前新郑裴李岗文化时期就有梅的种植。梅的迁移和分布与地理气候的变迁有很大关系。据古书籍记载，古代梅树曾分布于我国华北和西北一带，后因气温降低而缩小了梅的适宜栽培区域，目前主要分布在我国的亚热带地区及其与北温带的过渡地带，而华北和西北地区仅有零星栽培[2]。据调查数据显示，我国野生梅主要分布于四川、云南、西藏、湖北、贵州、湖南、广东、广西、江西、安徽、浙江、福建、江苏、陕西、台湾15个省(自治区)[3-4]。

　　目前，我国的四川、云南、西藏、贵州、湖北、湖南、广东、广西、福建、江西、安徽、浙江、江苏、河南、陕西、甘肃、台湾17个省(自治区)均有果梅栽培[5]，其中广东、福建、云南、浙江、江苏等省是中国果梅的传统产区，全国栽培面积为80000hm2左右。梅主栽品种主要为‘龙眼梅’‘软枝大粒梅’‘照水梅’‘白粉梅’和‘长农17’等。相比而言，观花用的梅花种植范围更加广泛，长春、沈阳、延安、拉萨和北京等地均有梅花的栽培，甚至海南省部分地区也有梅花的栽培[5]。

　　此外，老挝及越南北部也有梅的分布，日本、朝鲜、韩国均有较多的梅花栽培，新西兰、巴西、泰国、英国、法国、意大利、美国、德国等国家也有少量的梅花栽培[6]。除了中国以外，日本梅的栽培面积最大，从日本中部的东京到南部的和歌山都有种植，近20年种植区域和面积也比较稳定。据日本农林水产省统计数据，2017年日本全国梅产量为15000hm2左右，主要集中在和歌山、群马、奈良、长野、三重等地，栽培品种主要有‘南高’‘古城’和‘小梅’等。

　　1.2梅资源收集和鉴定评价

　　2011年，我国农业部批准建立国家级的果梅种质资源圃，依托单位为南京农业大学，经过后期的改建和扩建，目前占地5.3hm2，共收集了国内外近200份梅野生资源、地方品种和近缘种。所收集的梅种质资源主要来自我国台湾、云南、广东、浙江、福建、广西、湖南、四川、安徽、江苏等省(自治区)以及日本等其他国家。果梅种质资源圃对现有资源的植物学性状、园艺学性状和抗逆性进行了全面的鉴定和分析[7]，建立了果梅种质资源核心种质20份[8]，筛选出10多个花果兼用品种以及2个优质的抗寒果梅品种‘软条红梅’和‘细叶青’[9]，从47个果梅品种中鉴定出1个完全花比例较高的种质资源[10]。

　　除此以外，还通过田间鉴定和实验室鉴定相结合的方法鉴定出抗疮痂病的种质资源[11]以及自交亲和变异的种质资源‘早红’和‘四川白梅’[12-13]。通过多年连续的田间观测并结合实验室鉴定，明确了69个果梅品种的需冷量[14]以及43个梅品种的S基因型[15]，为不同地区选择品种和生产配置授粉品种提供了依据。采用分子标记技术对梅不同种质资源及其与近缘种杏、桃、李、樱桃等核果类果树的亲缘关系进行了系统分析，发现了梅演化的分子依据，尤其是日本梅是由中国传播的事实[16]，进一步通过基因组序列和叶绿体基因序列分析发现杏和梅的亲缘关系比其他近缘种更近[17]。

　　2梅基因组和叶绿体基因组的测序

　　2.1基因组

　　虽然木本植物的高度杂合性增加了基因组整合的难度，但Zhang等[18]利用全基因组酶切图谱技术(WGM)克服了组装难度，完成了梅全基因组测序和组装，构建了首个长度为237Mb的梅基因组图谱，并预测梅基因组实际大小约为280Mb;结合已完成的苹果和草莓基因组序列，重建了蔷薇科植物的祖先染色体，并深入分析苹果属、草莓属和李属3个种属不同的染色体融合、断裂的过程。此外，Zhang等[18]还探索了与梅开花相关的基因以及在低温下打破芽休眠的分子机制，共鉴定出6个与休眠相关的DAM基因，呈串联重复分布，在DAM基因上游有6个CBF基因的结合位点。

　　Sasaki等[19]推测DAM基因和多个CBF结合位点是梅提早解除休眠的关键因子，这些因子使得梅对温度变化非常敏感，从而导致梅的休眠期短而开花较早。梅基因组测序的完成推动了梅分子生物学研究的深入开展，提升了研究水平。梅花具有特殊而独特的香气。Hao等[20]鉴定出梅花香气重要成分为乙酸苯甲酯，同时分析了其所调控的基因苯甲醇乙酰基转移酶基因(BEAT)，该基因家族在梅基因组中为34个，而苹果只有16个，草莓只有14个，据此推测这些BEAT基因可增加乙酸苯甲酯含量的剂量效应，从而使梅具有独特的花香。

　　此外，Zhang等[21]以梅花的近缘物种山杏、山桃和李作为参照，构建了梅花品种的系统发育树，从16个亚群中选择7个梅花品种和1个野生梅花，与山杏、山桃、李进行重新测序和基因组组装，并结合已经发表的桃和梅花基因组，通过GWAS分析确定了多个数量性状基因座(QTL)和基因组区域，并发现MYB108基因和花色有关。

　　2.2叶绿体基因组

　　植物细胞中包含3大基因组:核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组。与核基因组相比，叶绿体基因组体积小，拥有相对独立的遗传物质叶绿体DNA、细胞质遗传、核苷酸替换率低、单倍体性质和高度保守的基因组结构[22-23]，因此叶绿体基因组被认为是系统发育研究的理想系统。1984年，烟草和地钱的叶绿体基因组测序完成[24]，这是最早报道的植物叶绿体基因组序列。截至2018年3月，NCBI上收录的完整的植物叶绿体基因组共有13602条。

　　高等植物叶绿体基因组DNA一般为双链环状结构，呈典型的四段式结构，极少数为线性分子结构，由1个大单拷贝区(LSC)、1个小单拷贝区(SSC)和1对反向互补重复区(IR)组成，其中IR区将LSC和SSC区分隔，大小一般为120～160kb。梅叶绿体基因组为典型的闭合双链环状DNA分子结构。笔者所在的实验室测序获得果梅叶绿体基因组全长为157815bp，LSC区长度为86113bp，SSC区长度为18916bp;Ira和IRb区长度相等，为26393bp。梅叶绿体基因组GC含量为36.74。其中，IR区GC含量为42.56，LSC和SSC区域的GC含量比IR区的分别低8%和12%。在梅的基因注释表中，梅叶绿体基因组编码133个基因，其中110个是unique基因。

　　这110个unique基因包括80个蛋白编码基因，26个tRNA基因，4个rRNA基因。在IR区上有18个基因重复，包括所有的8个rRNA基因，IR区域内还有13个基因。此外，共12个基因含有内含子，其中10个基因含有1个内含子，2个基因含有2个内含子。这些内含子中有9个分布在LSC区，2个分布在SSC区，3个分布在IR区[17]。这与Wang等[25]发表的梅叶绿体序列(NC_023798)类似，但在序列长度、基因组成和内含子数目上有所不同。梅核基因组和叶绿体基因组序列图谱的测序完成，有助于开发分子标记进行辅助育种和开展近缘物种的进化分析。

　　3梅花的发育研究

　　3.1雌蕊发育研究

　　梅花花器官通常由外到内包括4轮花器官:萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊，呈半径不等的同心圆排列。梅花不但具有独特的香气而且花型繁多，变异大，是研究花器官发育的良好材料，而果树雌蕊更是重要的生殖器官，因此雌蕊发育的分子生物学也成为关注的热点。梅完全花通常含有1枚正常发育的雌蕊，也有少数品种含有3至数枚雌蕊并且能够正常授粉。李晓颖等[26]对南京梅花品种花性状进行评价，结果发现梅花雌蕊有多种形态，单瓣品种雌蕊多发达，1枚雌蕊多数能正常发育并结实;重瓣花雌蕊变化较大，有完全正常的雌蕊，也有完全退化的雌蕊，雌蕊数量不定，最多为15枚;对所有梅花品种的统计表明:有136个品种(41.21%)的雌蕊数量为1～6个。

　　侍婷等[7]通过石蜡切片观察了果梅品种‘龙眼’和‘大嵌蒂’雌蕊分化进程，发现10月中下旬为雌蕊分化初期，11月下旬至12月上旬为雌蕊分化期，12月中旬以后为雌蕊分化末期，雌蕊分化基本完成，因此南京地区雌蕊分化的关键时期为10月上旬，而雌蕊发育的关键时期为12月上旬。梅花中除了具有正常生殖能力的完全花外，还包括雌蕊发育不正常的不完全花，主要表现为雌蕊的缺失、畸形和褐化。Gao等[27]研究表明，果梅品种‘大嵌蒂’的不完全花比例高达76.3%，不完全花的存在严重影响到梅果实产量。因此，雌蕊败育的分子机制也受到科研人员的关注，希望寻求解决雌蕊发育异常问题的途径，从而提高完全花比例，提高果实产量和品质。

　　Gao等[27]利用高通量测序技术对与完全花和不完全花雌蕊败育相关的miRNA进行了分析，鉴定出7个已知miRNA和6个新miRNA在2种花中表达差异显著。Wang等[28]发现Pm-miR319a影响梅花雌蕊的发育，并通过负调控目标基因Pm-TCP4促进雌蕊败育。同时，Shi等[29]发现完全花和不完全花差异蛋白中咖啡酰-辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)只存在于‘大嵌蒂’完全花中。

　　Sun等[30]进一步克隆了CCoAOMT基因，并通过洋葱瞬时表达试验证明CCoAOM蛋白定位在细胞质中;同时发现PmCCoAOMT在雌蕊发育前期‘大嵌蒂’中的表达量高于‘龙眼’，而在雌蕊发育后期则刚好相反，并且完全花中表达量高于不完全花;PmCCoAOMT的过量表达导致花变大、花瓣变深以及雌蕊形态改变，证明该基因对雌蕊的发育具有一定的作用。植物激素尤其是生长素是影响雌蕊发育的重要因素，Song等[31]研究发现植物生长素相应因子ARF基因对雌蕊发育起作用，尤其是PmARF13和PmARF17可能是梅花雌蕊发育所必需的。

　　3.2梅S基因型的鉴定及自交不亲和

　　梅为蔷薇科李属典型的配子体自交不亲和(gametophyticself-incompatibility，GSI)树种[35-36]。自交不亲和现象指可育的雌雄同花的被子植物在自花授粉后不能产生合子的现象，在蔷薇科植物中普遍存在。蔷薇科的配子体自交不亲和性受单一位点S-locus的至少2个多态性基因控制，即花柱决定基因S-RNase基因(S-ribonucleases)和花粉决定基因SLF基因(S-locusF-boxproteingene)或SFB基因(ShaplotypespecificF-boxgene)[37]。

　　3.2.1梅花柱S-RNase基因鉴定

　　自交不亲和现象首先在烟草属植物上证实存在，并且通过杂交试验首次发现了S基因的存在[38]。梅S基因研究起步较晚，直到2000年梅首个Sf-RNase(登录号:AB101437)等位基因在自交亲和品种中利用AS-PCR(allele-specificPCR)技术克隆，并且开发分子标记来鉴别自交不亲和品种[35，39]。Yaegaki等[36]运用RT-PCR技术扩增部分S-RNase基因编码区(MSRN1-3)，并确定了6个品种的S-基因型。Habu等[40]运用AS-PCR扩增技术克隆了S1至S11，以及Sf-RNase并且更新了3种S-基因型。

　　Entani等[41]克隆出与Habu等[40]登录序列不同的S9-RNase(登录号:AB092646.1)。Heng等[42]鉴定了S10至S16(登录号:DQ011150、DQ201191、DQ201192、DQ345781、DQ768219、DQ903312和EF990750)。Xu等[43]克隆了S17至S26(登录号:FJ602078—FJ602087)，并通过田间试验异花授粉验证了24个品种的S-基因型。

　　Wang等[44]克隆得到S30至S33共4个S-RNase基因(登录号:JN232975—JN232978)，并鉴定了17个品种的S-基因型。Gao等[45]运用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析克隆得到S34、S35、S36共3个S-RNase基因和6个SFB基因(PmSFB14、PmSFB18、PmSFB22、PmSFB24、PmSFB31和PmSFB34)。虽然梅自交不亲和研究起步较晚，但是从2000年到2013年，果梅的研究取得了较大进展。迄今为止，已经鉴定并登录的果梅S-RNase基因有S1—S26、S30—S36、Sf-RNase、S9-RNase、S10共36个S基因和40多个栽培品种的S-基因型，同时发现了4个自交亲和的品种，并进一步分析了其自交亲和变异的机制[46]。这些研究结果为生产配置授粉品种和育种组合的亲本选择提供了依据。

　　3.3梅季节性休眠分子机制

　　多年生木本植物季节性休眠是对外界不良环境条件适应的机制。根据季节性休眠的不同时期，一般分为3种类型:抑制性休眠、自然休眠和生态休眠[50]。虽然种子休眠和木本植物的季节性休眠机制相似，但也存在差异。梅树具有休眠期短、春季萌芽早的特点，是研究休眠过程，尤其是木本植物解除休眠的良好材料。植物休眠解除过程涉及到许多信号分子，其中植物激素是最重要的一种信号物质[51]。

　　脱落酸(ABA)、生长素(IAA)和赤霉素(GA)被认为是休眠的形成与解除过程中非常关键的信号分子，起着至关重要的作用[52-53]。Zheng等[54]研究发现，拟南芥ABA不敏感突变体(abi1—abi5)种子萌发对ABA诱导的生长抑制不敏感。

　　4梅分子标记开发

　　根据开发的方法梅分子标记分为2大类。第1类是以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记，包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单重复序列(SSR)、扩增片段多态性长度(AFLP)以及逆转座子分子标记;第2类是以DNA序列为核心的分子标记，典型的有单核苷酸多态性(SNP)和表达序列标签(EST)标记[65]。

　　Yamane等[66]利用RFLP技术使用Pm-SFB探针来分辨果梅自交不亲和S1至S8单倍型以及自交亲和单倍型，这是比较早的梅分子标记应用的报道。在基因组测序完成之前，分子标记作为梅品种鉴定和亲缘关系分析的重要手段被广泛应用。Li等[67]利用RAPD标记技术随机扩增基因组不同区域，并采用聚丙烯凝胶(PAGE)电泳检测扩增引物，提高了检测多态性数量，能够客观反映所测果梅品种间的遗传关系和遗传差异。Fang等[68]应用AFLP分子标记技术将中国和日本的14个品种分成2类，利用2对AFLP引物组合的多态性分别为57.92%和63.04%。

　　侍婷等[7]和高志红[69]利用SSR分子标记技术对果梅种质资源的遗传多样性进行了分析，并筛选了花果兼用的优异梅种质，建立了果梅的核心种质。Li等[70]利用SNP标记分析梅的遗传多样性和亲缘关系，研究表明果梅SNP的出现频率高于花梅，说明果梅品种间的遗传差异较大，而花梅品种的育种亲本相似或者地理起源相近，但试验证明果梅与花梅在遗传上具有很高的相似性，是同一树种中某些性状(主要是花器官)存在一定差异的不同品种类型。

　　2012年梅全基因组测序的公布为基于参考基因组发掘不同品种间基因SNP差异分析提供了方便[18]。Du等[71]利用EST数据库在全基因组上鉴定30个胚胎发育晚期丰富蛋白，这类蛋白除3号染色体外，在其他7条染色体上均有分布。Sun等[72]结合SSR和SNP分子标记构建了高密度连锁图谱来进行梅童期性状和树体结构等数量性状的QTL定位。Zhang等[73]利用简化基因组测序SLAF-Seq技术开发SLAF分子标记，用来构建高密度连锁图谱，其中SLAF分子标记包含8007个标记，平均标记距离为0.195cM，使其成为李属植物最密集的遗传图谱，并且将垂枝性状定位在7号连锁群上，为应用SLAF标记构建的高密度遗传图谱探究木本植物的重要特征提供参考。

　　5组培与遗传转化研究

　　目前，用于果梅组培与遗传转化的外植体类型主要包括叶片[74-75]、叶柄[76]、一年生枝条[74-77]、未成熟合子胚[75-79]等4大类，外植体灭菌主要使用75%乙醇和0.1%氯化汞消毒，基本培养基主要用MS、WPM、QL等，使用的细胞分裂素和生长素主要包括6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、6-糖基氨基嘌呤(KT)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、吲哚丁酸(IBA)等。朱丹红等[74]研究表明，一年生枝条基部的叶片，背面朝上放于培养基上诱导愈伤组织效果更佳。杨丽青等[78]研究表明，果梅的一年生枝条不宜在刚抽生的时候采样，枝条太幼嫩，容易受灭菌剂影响而褐化死亡，最好在新稍生长旺盛期采样，一般在4至6月。

　　杨洁等[79]研究表明，未成熟合子胚在长3.5～5.0mm的体胚诱导率和体胚诱导效果最佳。Ning等[80]研究表明，未成熟胚在以1/2MS为基本培养基，加入13.2μmol·L-16-BA和2.7μmol·L-1NAA的培养基上诱导效果最好，诱导率达到89.5%。

　　Gao等[81]研究表明，未成熟胚在以MS为基本培养基，加入1μmol·L-12，4-D和1μmol·L-16-BA的培养基上诱导效果最好。在组培和遗传转化过程中，不论是外植体的取样时间、灭菌方法的交叉组合，还是不同基本培养基以及不同的激素配比，都是影响外植体生长和增殖的重要因素。综上所述，虽然梅组培和再生研究有些零星的报道，也取得了一些经验，初步获得了组培快繁的技术体系，但组培苗的伸长生长和再生效率还存在很大问题，尤其是梅遗传转化体系至今仍未建立。

　　6问题与展望

　　梅作为原产于中国的特色树种，主要分布在中国和日本等东亚和东南亚地区。虽然果实具有较高的保健价值[82-83]，但因其为小水果，投入的科研力量与大宗水果相比还相对比较薄弱。针对资源挖掘和分子生物学研究，需重点开展以下研究工作。

　　1)深度鉴定种质资源和挖掘优异基因。随着城镇化的进程加快，越来越多栽植在城郊的梅园被毁，随之而来的是资源的流失，因此加快收集和保存资源应作为梅资源研究的重点工作。同时进一步深度鉴定已经收集的种质资源，明确其演化和进化规律，挖掘优异基因，为生产和科研服务。例如梅具有一些优异性状，如果实高酸低糖、休眠期短以及流胶病抗性等，其相关基因资源都有待进一步的研究和挖掘利用。

　　2)建立梅稳定高效的遗传转化体系。作为核果类果树的共性问题，梅遗传转化体系一直未能建立，这也是阻碍梅分子生物学研究水平进一步提升的瓶颈问题。只有利用高效的遗传转化体系才能进一步明确梅特有基因的功能。目前虽然已建立了梅的组培快繁体系，但也存在繁殖系数不高、生根困难等问题。因此，建立高效的遗传转化体系是今后梅研究的重点课题。

　　细胞学论文投稿刊物：《分子细胞生物学报》Journal of Molecular Cell Biology(双月刊)曾用刊名：实验生物学报;TheChineseJournalofExperimentalBiology，1936年创刊，现由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、中国细胞生物学学会共同主办,上海科学技术出版社出版。