云南小粒咖啡类黑精的抗氧化及减肥功能

　　摘要：目的：探讨云南小粒咖啡类黑精的抗氧化能力和减肥功能。方法：用热水提取法提取中烘焙度云南小粒咖啡中的类黑精(M总)，再将提取的类黑精产物按分子质量大小分成>100kDa(M，)、10～100kDa(M：)、<10kDa(M3)3个部分。用羟自由基、1，1-二苯基.2.三硝基苯肼(1，1.diphenyl一2.picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率和总还原力评价M总、M，、M：、M，的抗氧化能力;通过饲喂高脂饲料建立大鼠肥胖模型，检测不同质量浓度咖啡类黑精对肥胖大鼠体质量、体脂质量、血脂水平、脂体比、脂肪组织形态、肝脏组织形态等指标的影响。

　　结果：相同质量浓度下，云南小粒咖啡类黑精不同分子质量产物自由基清除能力和总还原力不同：不同剂量处理组咖啡类黑精均能降低大鼠体质量、体脂质量：肝组织切片显示，中、高剂量处理组大鼠肝脏组织结构完整、肝细胞大小一致、胞浆均匀、细胞核清晰;脂肪组织切片显示，高剂量处理组大鼠脂肪细胞较模型组减小，且排列均匀、结构完整。结论：云南小粒咖啡类黑精及不同分子质量产物均具有不同程度抗氧化能力;高质量浓度(72g/100mL)云南小粒咖啡类黑精具有一定的减肥作用，能抑制大鼠体质量的增加，减少肝脏内脂肪堆积，对肝脏具有一定的保护作用。

　　关键词：云南小粒咖啡：类黑精;抗氧化作用;减肥功能

　　咖啡原产于非洲埃塞俄比亚，从植物学上来说，是茜草科咖啡属，最早对其进行食用和栽培的是阿拉伯人Ⅲ。国际上通常根据咖啡果实颗粒的大小，将咖啡的三大原种划分为大粒种咖啡、中粒种咖啡、小粒种咖啡【2】。中国有98%的咖啡出自云南。云南种植的主要是小粒咖啡，具有“浓而不苦、香而不烈、略带果酸味”的独特特点。云南小粒咖啡因其独特的风味而深受消费者喜爱，随着人们生活水平、健康意识的提升，云南小粒咖啡的活性成分及其生理功能也备受瞩目。然而不同烘焙度咖啡的香气和口感也不一样，一般认为烘焙程度较低时，咖啡口感较酸，烘焙程度较高，咖啡口感较苦，适合的烘焙程度，能释放出咖啡豆的最大香气。

　　周斌掣如的研究表明，云南小粒咖啡采用中烘焙度时口感和香气较好。咖啡类黑精是咖啡豆在烘焙过程中，咖啡豆中的羰基和氨基化合物发生美拉德反应所形成的一类结构复杂、聚合度不等的棕褐色、大分子聚合物的混合体H。5】。由于其结构复杂，Bekedam等[6-7]在研究咖啡类黑精分子结构时，采用美拉德反应中间体的结构性能模型系统，将咖啡类黑精分为低分子质量(<3kDa)和高分子质量(>12kDa)类黑精，发现低分子质量类黑精中含有咖啡因、绿原酸和一些含氮小分子物质，高分子质量类黑精中含有阿拉伯半乳聚糖、酚基、蛋白质等物质。在功能研究中，通常使用<10kDa滤膜超滤分离类黑精来研究其功能，发现分子质量<10kDa咖啡类黑精具有抗氧化、降血压、抗菌活性、改善肠道微环境和结合风味物质等功能哺。21。

　　分子质量>10kDa的类黑精抗氧化功能尚未受到关注。目前，国内关于云南小粒咖啡多为其咖啡因、绿原酸、葫芦巴碱等生物活性物质功能的研究;烘焙条件、萃取方法对咖啡豆挥发性成分分析;烘焙条件、种植环境对云南小粒咖啡感官、品质的影响，针对云南小粒咖啡类黑精生理功能的报道较少。为研究云南小粒咖啡类黑精减肥降脂功能及不同分子质量产物抗氧化能力差异，本实验通过提取云南小粒咖啡类黑精及不同分子质量产物(<10、10～100、>100kDa)，用羟自由基、1，1-二苯基一2.三硝基苯肼(1，1-diphenyl一2.picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除力和总还原力来评价类黑精及分级产物抗氧化能力差异;运用大鼠构建肥胖模型，研究类黑精的减肥降脂功能，以期为云南小粒咖啡产品及功能食品开发提供科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1动物、材料与试剂

　　选用清洁级雄性SD大鼠70只，体质量(260±20)g，购自昆明医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(滇)2015.0002。基础词料：从昆明医科大学实验动物中心购置，依照GB14924.3—2010《实验动物配合饲料营养成分》¨纠配制，每lkg基础饲料主要含碳水化合物550g、脂肪50g、灰分70g、蛋白质220g、纤维素50g。

　　高热量饲料为实验室配制，参照“国食药监保化【2012】107号”附件8《减肥功能评价方法》高热量模型饲料配方，每5kg高热量饲料按基础词料3.5kg、蔗糖0.75kg、猪油0.75kg配比制成，烘干待用。中烘焙度的云南小粒咖啡豆，均从云南本土市场购买。二氯甲烷、抗坏血酸、无水乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、乙醚、甲醛、二甲苯、无水硫酸钠、DPPH美国Sigma公司。

　　1.2仪器与设备

　　722分光光度计、CTl4D11台式高速离心机、732型紫外分光光度计、全自动样品快速研磨仪、冷冻干燥机美国Labconco公司;Minimate切向流超滤系统美国颇尔公司;415R高速冷冻离心机德国Eppendorf公司：Cobasc311全自动生化分析仪德国罗氏诊断有限公司;RM2235切片机、ASP300S脱水机、DM750显微镜德国LEICA公司。

　　1.3方法

　　1.3.1咖啡类黑精的提取分离及纯化

　　提取参考Bekedam等H41的方法并加以改进，称取中烘焙度的云南小粒咖啡豆100g，用粉碎机粉碎至粒径0.2～O.4mm颗粒，备用。将研磨好的咖啡粉30g添加到90℃的180g去离子水中，并在90℃水浴中连续搅拌15min，冷却后用布氏漏斗过滤，滤液用二氯甲烷脱脂，于40℃水浴锅中去除二氯甲烷后，将样品预冻后用冷冻干燥机制成冻干样品并称其质量，过滤后的咖啡渣重复上述操作3次。将中烘焙度的云南小粒咖啡类黑精样品(M总)配制成2g/100rnL的溶液，用0.2“m的滤膜片过滤后，分别用100、10kDa的滤膜分级截留得到截留液和滤出液“51，滤出液重复超滤4次，每次吸取截留液后用10mL去离子水洗滤3次，以减少样品残留，将最终收集的截留液和滤出液预冻后冷冻干燥，分别得到分子质量为>100、10～lOO、<10kDa的咖啡类黑精M1、M2、M3。

　　以二氯甲烷为溶剂，用索氏提取器进行纯化，脱除类黑精样品中的咖啡因n61。将提取的中烘焙度云南小粒咖啡类黑精样品放入索氏提取器的滤纸筒中，加入30mL二氯甲烷，再向圆底烧瓶中加入80mLZ.氯甲烷，42℃水浴加热回流提取8h，随后更换新的二氯甲烷80mL，再继续抽提，当滤纸筒边缘不析出白色晶体时，结束回流提取，挥发干类黑精样品中的二氯甲烷，待用。

　　1.3.2清除DPPH自由基能力测定

　　参考其他物质DPPH自由基清除力测定方法¨7。211，精密称取DPPH78.9mg，用无水乙醇定容至50mL，摇匀后得到浓度为4mmol/L的DPPH母液。使用时将DPPH母液用无水乙醇稀释，工作液浓度为0.1mmol/L。将不同分子质量样品用无水乙醇稀释为质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L的溶液，取不同质量浓度样品溶液2mL，于EP管中进行以下3组反应：2mL无水乙醇与2mLDPPH溶液混合;2mL样品溶液与2mLDPPH溶液混合;2mL样品溶液与2mL无水乙醇混合。分别摇匀，避光反应30rain。使用紫外.可见分光光度计在517nm波长处测量各体系吸光度¨7‘211。实验平行进行3次，取平均值，根据式(1)计算DPPH自由基清除率。清脚%=生之半Ⅷ。式中：A。为2mL乙醇与2mLDPPH溶液的吸光度;A.为2mL样品溶液与2mLDPPH溶液的吸光度;A：为2mL样品溶液与2mL无水乙醇的吸光度。

　　1.3.3清除羟自由基能力测定

　　参考其他物质羟自由基清除能力测定方法旺2。271，将不同分子质量样品用蒸馏水溶解，配制成质量浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L的溶液，取5支试管，依次标记为1～5，各试管中分别加入不同质量浓度样液2mL，再按顺序依次加入9mmol/L水杨酸。乙醇溶液2mL、9mmol/LFeSO。溶液2mL，最后加入8.8mmol/LH，0，溶液2mL启动反应，室温反应1h后，在510nm波长处测定各待测液的吸光度Ax，以蒸馏水为空白对照4。考虑到样品本身的吸光度，另取5支试管，各试管中分别加入不同质量浓度样液2mL、9mmol/L水杨酸一乙醇溶液2mL、9mmol/LFeSO。为空白对照液的吸光度;A。为加入类黑精后的吸光度;Ax。为不)JWI-I：0：的类黑精溶液本底吸光度。

　　1.3.4总还原力测定

　　参考Benjakul等伫鼬的方法，采用铁氰化钾法测定总还原力。取不同质量浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L)溶液2.5mL于离心管中，再依次加入2.5mL0.2mol/LpH6.6磷酸盐缓冲液、2.5mL质量分数1%铁氰化钾溶液，混匀后于50℃水浴中反应20rain，取出后立即用冷水冷却，并加入2.5mL质量分数10%三氯乙酸溶液，混匀后于5000r/min离心10min。取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL质量分数0.1%FeCl，溶液，混匀室温静置10rain，700rim波长处测定其吸光度口91，吸光度越高表示样品的还原力越强。

　　1.3.5咖啡类黑精对肥胖大鼠的减肥作用

　　1.3.5.1实验动物造模

　　选取精神状态良好、无异常的70只SD大鼠进入动物房，饲养环境：温度20～25℃，相对湿度40%～65%及光照12hid，基础饲料适应性饲养7d，适应期结束后称其体质量，参照“国食药监保化[20121107号”附件8《减肥功能评价方法》，按照大鼠体质量，将其随机分成2组，其中10只大鼠作为空白对照组给予基础饲料，60只大鼠作为模型组给予高热量饲料。实验过程中，每周记录给食量、撒食量、剩食量，称量体质量1次。喂养2周后，给予高热量饲料的60只大鼠按体质量增量排序，淘汰1/3体质量增量较低的大鼠，对组内余下的40只大鼠继续饲喂高热量饲料。饲喂6周后，测量体质量进行统计分析，模型组的大鼠体质量超过空白对照组大鼠体质量20%，空白对照组体质量和增质量与模型组相比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，肥胖模型成功。

　　1.3.5.2实验动物的分组及受试样品的给予

　　造模成功后将40只肥胖大鼠依据体质量按照随机区组法分成4组，分别是模型组和低、中、高3个剂量处理组，各组间大鼠的体质量差异无统计学意义(P>0.05)。模型对照组和3个剂量处理组给予高热量饲料，空白对照组给予基础饲料。中度烘焙的云南小粒咖啡类黑精剂量按人均体质量(60kg)、每天饮用纯咖啡30g、中度焙烤咖啡中热水提取类黑精占咖啡干物质的24%计算。中度烘焙的云南小粒咖啡类黑精摄入量为120mg/(kg·dm。)，以人体摄入量的5倍(0.6g/(kg。dmb))、10倍(1.2g/(kg‘dmb))、30倍(3.68/(kg·drab))剂量进行灌胃(0.5mldlOOg)，通过计算得到低、中、高3个剂量处理组样品质量浓度分别为12、24、72g/100mL，配制后当天使用。空白对照组和模型组给予生理盐水，灌胃剂量为0.5mL/100g。受试样品给予时间6周，每周记录给食量、撒食量、剩食量，并称量体质量1次。实验结束时禁食不禁水16h，称体质量，乙醚麻醉，股动脉采血，采血后尽快分离血清，测定血清总胆固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白一胆固醇(10wdensitylipoprotein—cholesterol，LDL.C)、高密度脂蛋白.胆固醇(highdensitylipoprotein.cholesterol，HDL.C)的水平口01。解剖大鼠，取腹腔脂肪及各脏器并称质量，计算脂体比。大鼠肝脏、腹腔脂肪用体积分数10%甲醛溶液固定口1。321。

　　1.3.5.3观察指标及测定体质量：每周测定1次，反映中度烘焙的云南小粒咖啡类黑精减肥效果。

　　2结果与分析

　　2.1云南小粒咖啡类黑精的提取及抗氧化性

　　2.1.1咖啡类黑精对DPPH自由基的清除作用

　　云南小粒咖啡类黑精中分子质量<10kDa(M，)对DPPH自由基的清除效果与未分离的云南小粒咖啡类黑精(M总)对DPPH自由基的清除效果最为相近，均呈现较强的清除能力，云南小粒咖啡类黑精中分子质量>100kDa(M，)对DPPH自由基的清除效果较M总、M：、M，弱。总体来看，质量浓度在0.4～0.8g/L时，DPPH自由基清除率随质量浓度增加而增加，而0.8--1.0g/L其清除率呈下降趋势。

　　研究报道，小分子类黑精产物呈现较强清除DPPH自由基能力，可能是因为美拉德反应中形成的色素类物质提供氢与DPPH反应，还可能因为这些小分子化合物以非共价键的形式连接在类黑精骨架上，分级之后小分子物质解离出来暴露更多的羟基，使得清除DPPH的能力增强【】81。本研究发现云南小粒咖啡小分子质量类黑精呈现较强的清除DPPH能力，同时发现未分级类黑精及分子质量为10～100kDa的类黑精均呈现较强清除DPPH自由基能力，具体机制有待进一步研究。

　　2.1.2咖啡类黑精对羟自由基的清除能力

　　云南小粒咖啡类黑精中分子质量>100kDa(M，)对羟自由基的清除能力较M”M溺。未分离类黑精及分子质量为10～100kDa和<10kDa的类黑精对羟自由基的清除能力随质量浓度的增加而增强，其质量浓度在1.O～4.0g/Lpq呈线性增强。Delgado.Andrade等口卸在咖啡类黑精抗氧化研究中发现，咖啡类黑精骨架上小分子复合物的抗氧化性更强。本研究发现除分子质量>100kDa的类黑精以外，其他类黑精及其分级产物均有较强清除羟自由基的能力。提示对于云南小粒咖啡，类黑精分子质量<100kDa的产品及功能食品也可以作为未来开发的关注点。

　　3结论

　　云南小粒咖啡类黑精及不同分子质量产物均有一定清除DPPH自由基和羟自由基的能力。在相同质量浓度下，对DPPH自由基的清除能力由高到低依次为：M总>M，>M：>M，，对羟自由基的清除能力由高到低依次为：M总>M3>M：>M】。采用铁氰化钾测定类黑精及不同分子质量产物的总还原力，结果表明，M总、M。、M，、M，均具备良好的抗氧化活性，总还原力由高到低依次为：M3>M2>M总>MI。肥胖模型建立成功后，对肥胖大鼠给予受试样品，结果显示：1)云南小粒咖啡类黑精具有一定的减肥作用，能抑制大鼠体质量的增加及减少肥胖大鼠体脂含量;2)高剂量处理组云南小粒咖啡类黑精能够提高大鼠HDL.C水平，对HDL.C有较好的保护作用;3)中剂量处理组和高剂量处理组云南小粒咖啡类黑精对实验大鼠的肝脏有较好的保护作用，能促进脂肪代谢，能较好地改善肝内脂肪堆积的症状。

　　食品方向论文范文：食品添加剂在食品业的应用及安全对策

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