基于微卫星分子标记的凡纳滨对虾商业苗种遗传多样性分析

　　摘要 为研究我国凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)商业苗种的遗传多样性特征，于河北、山东、广东、海南等地采集了6个有代表性的凡纳滨对虾品牌苗种，分别命名为黄骅R、东营M、广州P、广州Z、海南S和海南Z，以8个微卫星标记检测其遗传多样性‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 结果显示，6个品牌的凡纳滨对虾在8个位点呈现不同程度的多态性，其平均等位基因数(Na)、期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)和多态信息含量(PIC)分别为4.5~9.5、0.516~0.733、0.346~0.550和0.472~0.700，各品牌遗传多样性丰富程度从高到低分别为黄骅R>广州Z>广州P>海南Z>东营M>海南S‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 哈迪–温伯格平衡(HWE)检验显示，4.17% (2/48)的检测结果表现为显著的偏离(0.01 分子变异方差分析(AMOVA)发现，12%的变异来自品牌间，24%的变异来自品牌内个体间，其余64%的变异均来自所有品牌个体。 UPGMA聚类分析结果显示，6个品牌的凡纳滨对虾聚为2个明显的分支，广州P和广州Z聚为一支，东营M、黄骅R、海南Z和海南S聚为一支。 主成分分析(PCA)结果显示，各品牌凡纳滨对虾无法单独进行聚类。 本研究初步分析了当前国内养殖凡纳滨对虾的遗传背景，实验结果可为凡纳滨对虾良种选育提供数据支撑。

　　关键词 凡纳滨对虾; 商业苗种; 微卫星; 遗传多样性

　　凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)原产地主要为中、南美的秘鲁北部至墨西哥太平洋沿岸，尤其以厄瓜多尔沿岸分布最为密集(王兴强等, 2004)。 凡纳滨对虾为世界三大养殖对虾之一(张伟权, 1990)，其产量约占全球对虾产量的70%(张龙等, 2019)，具有成活率高、食性广、生长快、适应能力强等优点。 凡纳滨对虾于1988年从美国引入，之后迅速在全国范围内普及(于洋, 2014; 唐扬等, 2018)，成为我国海水养殖动物中养殖发展最快的一个种类(马春艳等, 2011)。 目前，我国已成为世界上凡纳滨对虾养殖产量最高的国家(颉晓勇等, 2008; 童馨等, 2009)。

　　农艺师论文投稿刊物：渔业科学进展(双月刊)是由中国水产科学研究院黄海水产研究所和中国水产学会主办、国内外公开发行的学术期刊。

　　随着我国凡纳滨对虾市场需求量的增大，对虾苗种培育方式也出现了转变。 目前，在集约化苗种培育技术已达峰值的背景下，有些育苗场为了进一步降低成本，种虾不经选育，长期近交繁殖，随着养殖产量的增大，随之而来的问题也越来越多。 最大的问题莫过于养殖对虾遗传多样性下降，加之外来亲本得不到更新，国内养殖对虾出现了种质退化、病害暴发频繁的现象。 从长远角度来看，查清我国凡纳滨对虾遗传背景，对进一步培育优良品种和促进可持续健康养殖具有重要指导意义。

　　分子标记目前已广泛运用于水产动物育种中(张琼等, 2011; 孙苗苗等, 2017; 王军等, 2018)，其中，又以微卫星(Microsatellite或Simple Sequence Repeats)分子标记应用最为普遍。 微卫星标记是2~6个碱基为核心的短串联重复序列，重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性且数量丰富，分布于生物体整个基因组中(Tautz, 1989; Schl? tterer et al, 1992)。 微卫星标记具有多态性高、重复性好、操作简单、共显性遗传等优点，被广泛用于对虾群体遗传多样性分析(Bringmann et al, 1996; Postlethwait et al, 1998; 张天时等, 2005; 曾地刚等, 2008)。 本研究利用8个扩增稳定的微卫星位点，对国内6个商业品牌凡纳滨对虾苗种进行遗传多样性分析，初步分析当前国内养殖凡纳滨对虾的遗传背景，为凡纳滨对虾优良品种的选育提供基础数据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　选用我国有代表性的6个品牌凡纳滨对虾商业苗种[平均体长为(49.73±1.53) mm，平均体重为(1.41± 0.11) g]，分别命名为黄骅R、海南Z、海南S、广州Z、广州P和东营M。 每个品牌取30尾个体进行肌肉组织DNA提取，共计180尾凡纳滨对虾个体。

　　1.2 实验方法

　　采用天根海洋动物组织DNA提取试剂盒进行肌肉组织DNA提取，利用紫外分光光度计(BioImaging ystems, UVP)进行DNA浓度测量，并根据测量结果将DNA稀释至50 ng/μl。 将稀释得到的DNA利用 8个微卫星位点进行PCR扩增。 PCR反应体系：总体积为20 μl，其中，模板DNA 1.5 μl，(Vazyme) 2 × Taq Master Mix (Dye Plus) 10 μl，正向和反向引物 (10 mmol/L)各0.8 μl，灭菌超纯水6.9 μl。 PCR反应程序：95℃预变性3 min; 95℃变性30 s; 72℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环; 72℃延伸5 min; 4℃保存。 PCR产物微卫星分型于生工生物工程(上海)股份有限公司，利用ABI 3730XL测序仪完成。

　　1.3 数据处理

　　对6个品牌凡纳滨对虾商业苗种进行哈迪–温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)检测和遗传多样性分析。 利用GENEPOP version 3.4软件进行HWE检验，得到精确P值(PH-W)。 通过Cervus 3.0计算各位点的等位基因数目(Number of alleles, Na)，观测杂合度(Observed heterozygosities, Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosities, He)、8个微卫星位点的多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)和无效等位基因频率[Null alleles frequency, F(Null)]。

　　利用GenAlEx 6.51软件计算6个品牌凡纳滨对虾在各位点的香农多样性指数(Shannon's diversity index)、8个位点每个品牌特有等位基因(Private alleles)平均值、各品牌间的遗传分化程度和基因流(包括总的FST值以及两两品牌间的FST值); 分子变异方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)，估测遗传变异在品牌内和品牌间的分配情况; 6个品牌间Nei’s无偏遗传距离、遗传相似性系数、品牌间遗传距离矩阵、个体间遗传距离矩阵; 利用品牌间和个体间遗传距离矩阵进行主成分分析(Principal coordinate analysis, PCA)。 利用NTSYSpc 2.1软件按照遗传一致度进行6个品牌凡纳滨对虾UPGMA聚类。

　　2 结果

　　2.1 6个商业品牌凡纳滨对虾苗种遗传多样性分析

　　在8个微卫星位点中，6个品牌凡纳滨对虾总等位基因数为36~76个，最大为黄骅R，最小为东营M。 各品牌平均等位基因数为4.5~9.5个。 黄骅R平均每个微卫星位点存在1.625个特有等位基因，在所有品牌中最多。 东营M平均每个位点存在0.125个特有等位基因，为各品牌中最少。 8个微卫星位点的多态信息含量(PIC)值为0.343~0.925，最高为TuMXLv7.56位点，最低为M1103位点，除M1103位点外，其他7个微卫星位点PIC都大于0.5。 黄骅R、广州Z和海南Z的香农多样性指数较高，其他3个品牌较低。 8个微卫星位点的无效等位基因频率范围为0.031~0.403，5个位点存在无效等位基因。 8个微卫星位点分别对6个品牌凡纳滨对虾进行了48次HWE检验。 其中，4.17%(2/48)的检测结果表现为显著的偏离(0.01 0.05)。

　　2.2 6个商业品牌凡纳滨对虾的遗传分化

　　分子变异方差分析(AMOVA)发现，仅有12%的遗传变异来自品牌间，24%来自品牌内个体间，其余64%的变异均来自所有品牌个体，这表明遗传变异主要存在于个体间。

　　6个品牌凡纳滨对虾商业苗种的F统计量分别为0.359 (FIT)，0.273 (FIS)，0.118 (FST)。 两两品牌间的值FST在0.034和0.111之间，均 <0.15，且明显的分成两部分。其中，小于0.05的为4组，占全部15组的26.67%，没有出现遗传分化(FST <0.05);介于0.05和0.15之间的为11组，占全部15组的73.33%，为中等程度分化(0.05 另外，从基因流分布情况来看，两两群体间Nm>1，范围为1.806~7.027。

　　2.3 6个商业品牌凡纳滨对虾的遗传聚类

　　东营M和海南Z品牌间的遗传距离最近(0.128)，遗传相似性系数最大(0.880)，亲缘关系最近; 广州P和海南S品牌间的遗传距离最远(0.549)，遗传相似性系数最小(0.578)，亲缘关系最远。 6个品牌的凡纳滨对虾聚为2个明显的分支，广州P和广州Z聚为一支，东营M、黄骅R、海南Z和海南S聚为一支。

　　2.4 6个商业品牌凡纳滨对虾遗传关系主成分分析

　　主成分分析(PCA)结果显示，6个品牌凡纳滨对虾商业苗种产生了明显的遗传歧化。 其中，广州P和广州Z最为聚集，其次为东营M和海南Z，之后为黄骅R和海南S，主成分1 (Coord.1)和主成分2 (Coord.2)共解释了总遗传变异的71.22%‍‌‍‍‌‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‌‍‍‍‌‍‍‍‍‌‍‌‍‌‍‌‍‍‌‍‍‍‍‍‍‍‍‍‌‍‍‌‍‍‌‍‌‍‌‍。 在个体水平上，主成分1 (Coord.1)和主成分2 (Coord.2)共解释了总遗传变异的20.05%。 6个品牌的180尾凡纳滨对虾个体聚集较为集中，其中，广州P、广州Z和黄骅R 3个品牌的凡纳滨对虾交集最大。 同时，每个品牌的凡纳滨对虾个体无法单独聚为一类。

　　3 讨论

　　微卫星分子标记在种内有高度的遗传变异，是群体遗传分化分析的有效标记(孙效文等, 2008)。 微卫星分子标记广泛分布于基因组中，数量众多，容易检测，在分子辅助育种和物种多样性检测等方面被广泛应用(张丽娟等, 2014)。 群体的遗传多样性来源于物种适应复杂环境和生存进化(Li et al, 2016)，其主要表现在等位基因数的丰富和均匀程度、遗传杂合度的大小、多态信息含量的高低3个方面(Beardmore et al, 1997; 王鹤等, 2016)。

　　研究发现，等位基因越丰富，遗传杂合度数值越大，多态信息含量越高，则群体遗传变异更高，更能应对环境变化，也更能产生优质的种质资源(Eschenroeder et al, 2016)。关于凡纳滨对虾微卫星标记开发和筛选的工作已有大量报道(Meehan, et al, 2003; 马宁等, 2013; 杨铭等, 2017)。 本研究从实验室发表过的文章(李东宇等, 2016)中筛选出8个扩增稳定的微卫星位点，分析了6个国内品牌的凡纳滨对虾商业苗种的遗传多样性、遗传结构和亲缘关系。 结果显示，87.5% (7/8)的位点平均多态信息含量(PIC)都在0.5以上。

　　根据Botstein等(1980)提出的衡量标准，当PIC>0.5时，意味着该位点为高度多态位点，这也说明本研究所引用的微卫星标记的多态性较高。 基因杂合度是衡量群体遗传变异水平的理想参数(王日芳等, 2017)，8个微卫星位点中的观测杂合度(Ho)平均为0.486，期望杂合度(He)平均为0.745，观测杂合度小于期望杂合度，也从一个侧面说明了国内商业苗种凡纳滨对虾出现了杂合子缺失、纯合子过剩的情况。

　　在进行微卫星分型的8个位点中，有5个(62.5%)位点显著偏离HWE (P <0.05)。产生该结果的原因：一方面为实验对虾纯合子过剩、杂合子缺失; 另一方面为水产动物生物结构较为简单，从而导致的遗传变异度也较高。 因此，造成微卫星位点在同一物种不同个体中发生碱基形态和数目的变异，无法扩增正确的等位基因，扩增的无效等位基因会导致分型结果显著偏离HWE (舒妙安等, 2011; 宋忠魁等, 2013)。

　　亲缘关系的远近可以用遗传距离来反映(陈子桂等, 2016; 刘洪涛等, 2018)。 在本研究中，遗传距离最大的2个品牌是广州P和海南S，遗传距离最小的2个品牌是东营M和海南Z，并且针对个体的遗传关系主成分分析(PCA)表明，6个品牌的凡纳滨对虾无法依照每个品牌单独聚集，品牌间亲缘关系较为接近。 这种结果表明，当前国内不同品牌的凡纳滨对虾来源存在一定的相似性，也可能是二代、三代苗种导致部分品牌对虾出现近交情况，使其亲缘关系逐渐接近。

　　种苗处于对虾产业链上游，其质量对养殖成败起关键作用(黄小帅等, 2019)。 本研究所分析的6个品牌凡纳滨对虾商业苗种中，黄骅R与广州Z具有较高的遗传多样性，不同品牌的商业苗种间的遗传特征存在一定差异。 在当前凡纳滨对虾养殖规模不断扩大的情况下，研究遗传因素与养殖生产性能之间的关联尤为重要，只有充分掌握对虾群体的遗传背景，才能合理利用杂交优势进行良种选育。

　　作者：方振朋1,2 孟宪红2① 李旭鹏2 栾 生2 曹家旺2 陈宝龙2 孔 杰2 闫茂仓3 胡利华3