鸡粪中 4 种抗生素在青菜中的累积动态及生物炭的阻控作用

　　摘 要：为探究鸡粪中的抗生素在蔬菜中的累积规律，通过盆栽试验研究了鸡粪中四环素(TC)、土霉素(OTC)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)4 种抗生素在青菜中的累积动态，探讨了小麦秸秆炭、稻壳炭对鸡粪中抗生素在青菜中累积的阻控效果。结果表明：鸡粪中 4 种抗生素均可被青菜吸收，在青菜移栽后的第 10 天青菜中抗生素的累积浓度达到最高，随后浓度逐渐下降;在鸡粪中添加相同浓度(200 mg·kg-1)抗生素时，移栽 10 d 的青菜中 SM2的累积浓度最高(957.35 μg·kg-1)，OTC、TC 次之(分别为 300.17 和 216.75 μg·kg-1)，SMZ 累积浓度最低(36.62 μg·kg-1);青菜中抗生素的累积浓度随着鸡粪中抗生素添加浓度的升高而升高。小麦秸秆炭和稻壳炭可显著降低鸡粪中 4 种抗生素在青菜中的累积，但两种生物炭的阻控效果差异不显著，土壤中抗生素有效态浓度的显著降低是生物炭减少青菜中抗生素累积的主要原因。

　　关键词：鸡粪;抗生素;青菜;累积;生物炭

　　抗生素作为疾病预防与治疗药物、生长促进剂、饲料添加剂等被广泛用于畜禽和水产养殖业中。中国每年抗生素生产量约为 21 万 t，大部分用于畜禽养殖业[1]。畜禽摄入的抗生素有 30%～90%以原药或代谢产物的形式排出体外[2-3]。因此，畜禽粪便中抗生素的浓度比较高，如果不经处理直接作为肥料施用于农田时，其中的抗生素就进入农田土壤，从而对土壤环境造成污染[4-5]。研究表明，土壤和畜禽粪便中的抗生素可以被蔬菜等农产品吸收[6-8]，再通过食物链进入人体，可引起人体的过敏反应、肾脏损害、造血系统损伤及致癌、致畸等毒理效应，严重威胁人体健康。因此，畜禽粪便中抗生素在蔬菜等农产品中的累积问题日益引起人们的担忧。控制畜禽粪便中抗生素污染已刻不容缓。

　　畜禽粪便中抗生素的去除是控制抗生素污染的重要途径之一，而好氧堆肥和厌氧发酵是畜禽粪便无害化处理的常用方法，经过处理后，畜禽粪便中大部分抗生素浓度会明显降低，但不能将畜禽粪便中的抗生素完全去除，而且处理时间比较长，影响处理效果的因素比较多[9-11]。因此，国内外学者相继开展了抗生素污染的其他控制方法研究。生物炭是在限氧条件下热裂解生物质原料制得的富炭固体产物[12-13]，具有较大的比表面积、良好的孔隙结构以及丰富的表面官能团。研究表明，生物炭不仅对水中的抗生素有良好的吸附去除效果[14-15]，而且生物炭对土壤中的抗生素也有较好的吸附效果。任美等[16]研究表明，生物质炭的添加显著增强紫色土对抗生素的吸附与固持作用。

　　Vithanage 等[17]研究表明，生物炭对砂壤土中磺胺二甲嘧啶的阻控效率可达 89%。由此可见，生物炭对水和土壤中的抗生素有很强的吸附作用。生物炭对抗生素具有极强的吸附能力，对抗生素在土壤中的迁移具有阻控作用[18]，而生物炭对畜禽粪便中抗生素向蔬菜中的迁移是否有阻控作用却鲜见报道。蔬菜种植过程中会施用鸡粪、猪粪等有机肥。青菜是人类最常食用的蔬菜之一，富含维生素 C、蛋白质、胡萝卜素以及铁、钙、钾、钠、镁等微量元素。本文通过土培试验，以青菜为研究对象，研究鸡粪中不同浓度的四环素、土霉素、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶在青菜中的累积动态，考察小麦秸秆炭与稻壳炭的添加对鸡粪中 4 种抗生素在青菜中累积的阻控效果，以期为畜禽粪便的安全资源化利用提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 药品与试剂

　　磺胺二甲嘧啶(SM2)，纯度99%，萨恩化学技术(上海)有限公司;磺胺甲噁唑(SMZ)，纯度 98%，上海麦克林生化科技有限公司;四环素(TC)，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司;土霉素(OTC)，纯度 98%，上海泰坦科技股份有限公司。甲醇和乙腈为 HPLC 级，试验用水为超纯水(美国 Millipore 公司)。

　　1.1.2 供试材料

　　土壤：采自安徽农业大学农翠园苗圃地 0 ~ 20 cm 的表层土壤，土壤类型属于黄褐土，土壤 pH 7.61，有机质含量 11.1 g·kg-1，阳离子交换量，14.6 cmol·kg-1，全氮 0.085%，有效磷 7.4mg·kg-1，速效钾 137 mg·kg-1。土壤抗生素残留检测表明，该土壤中无 TC、OTC、SM2 和 SMZ 的残留。土壤经风干去除石块等杂质后研磨过 2 mm 筛。青菜：品种为改良上海青(合肥市合丰种业有限公司)。鸡粪：堆肥发酵过的鸡粪，由合肥某养鸡场提供，经检测不含 TC、OTC、SM2 和 SMZ 的残留。生物炭：小麦秸秆炭(安徽帝元现代农业投资发展有限公司)、稻壳炭(安徽鑫泉米业有限公司)，磨碎后过 100 目筛。

　　1.1.3 仪器

　　超高效液相色谱串联质谱仪(XevoTQ MS，美国 Waters 公司)，氮吹仪(N-EVAP112，美国 Organomation Associates 公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 土培试验

　　鸡粪中不同浓度的 4 种抗生素在青菜中的累积动态：先在鸡粪中加入不同量的抗生素混合标准溶液，混合均匀，使得鸡粪中每种抗生素的浓度分别为 0、10、20、50、100 和 200 mg·kg-1;然后按照鸡粪:土壤=20:1(g·kg-1)的比例将添加了抗生素的鸡粪与土壤充分混合均匀，装盆，每盆 1kg，并施入复合肥(N-P-K：15-15-15)0.2 g，放在温室中平衡老化一周后将事先育好的青菜苗移栽，每盆 3 株。常规水分管理，在不同时间取样测定青菜中抗生素的浓度。每个处理 3 个平行，同时设置无菜对照。

　　生物炭对鸡粪中 4 种抗生素在青菜中累积的影响：先在鸡粪中加入抗生素混合标准溶液，混合均匀，使得鸡粪中每种抗生素的浓度为 100 mg·kg-1，再将 20 g 阻控剂加入 20 g 鸡粪中，然后按照鸡粪﹢阻控剂:土壤=40:1(g·kg-1) 的比例将添加了抗生素的鸡粪+阻控剂与土壤充分混合均匀，装盆，每盆 1kg，并施入复合肥(N-P-K：15-15-15)0.2 g，放在温室中平衡老化一周后将事先育好的青菜苗移栽，每盆 3 株。常规水分管理，在不同时间取样测定青菜、土壤中抗生素的浓度、土壤中抗生素有效态浓度、微生物多样性及青菜生理生化指标。每个处理3 个平行，同时设置未添加阻控剂的对照。

　　1.2.2 样品中抗生素的测定

　　土壤和青菜中磺胺类抗生素用 Na2EDTA-磷酸盐缓冲溶液-乙腈进行振荡提取，经分散固相萃取材料(PSA、C18、MgSO4)净化和氮吹至近干后用 1%甲酸定容 1.0 mL， 过0.22 μm 滤膜，用 UPLC-MS/MS 法测定。土壤和青菜中四环素类抗生素用 0.1 mol·L-1 Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：甲醇=1:1 进行振荡提取，重复提取 1 次，用分散固相萃取材料(PSA、C18、MgSO4)进行净化，用氮吹仪浓缩，用 1%甲酸定容 1.0 mL，过 0.22 μm 滤膜，用 UPLC-MS/MS 法测定。

　　在两种基质中 SMZ 的回收率为 99.6% ~ 101.8%，SM2 的回收率在 60% ~98.6%，TC 的回收率在 70.3% ~ 120.9%，OTC 的回收率在 65% ~ 136.8%，在青菜基质中，4 种抗生素的检测限在1.6 ~ 9.3 ng·L-1之间，定量限在15.7 ~17.5 ng·kg-1之间;在土壤基质中，4 种抗生素的检测限在 0.2 ~ 79.4ng·L-1之间，定量限在 0.5 ~ 264.7 ng·kg-1之间。土壤中有效态抗生素采用 0.1 mol·L-1 CaCl2 溶液提取，土液比 1:8，振荡提取 30 min，离心后吸取上清液过 0.22 μm 滤膜过滤，测定方法同上。

　　1.2.3 数据分析

　　运用 Excel 进行数据处理，用SPSS19.0 软件进行差异显著性分析，利用 Origin2018 软件绘图。

　　2 结果与分析

　　2.1 不同种类抗生素在青菜中的累积动态

　　以 SMZ、SM2、TC 和 OTC 4 种抗生素为目标化合物，通过土培试验考查鸡粪中这 4 种抗生素在青菜中的富集动态规律。在第 0 天至第 10 天，蔬菜中 4 种抗生素的浓度均随着培养时间的延长而迅速增大，并且都在第 10 天时抗生素残留浓度达到最高，而在第 10 天至第 17 天蔬菜中抗生素的浓度快速降低，这可能是由于青菜对抗生素的代谢和生长稀释作用导致的。

　　17 d 后残留抗生素的浓度降低减缓。因此，当鸡粪作为肥料施入土壤后，抗生素会被蔬菜吸收，并且呈一定的规律性。但 4 种抗生素在青菜中的富集能力不同，在鸡粪中4 种抗生素浓度相同的条件下，SM2 最容易被青菜吸收，在第 10 天时在青菜中的富集浓度均为其他 3种抗生素浓度的 2 倍以上，然后，依次是 OTC、TC和 SMZ，青菜对 SMZ 富集浓度最低。这可能是由于抗生素是离子型有机污染物，不同抗生素的logKow、pKa 不同，在土壤 pH 7.61 条件下，4 种抗生素在土壤中的存在形态及各形态的比例不同，其中 SMZ 绝大部分以阴离子形态存在，而其他 3 种抗生素以中性分子和阴离子形态存在，说明青菜对中性分子形态的抗生素具有较强的吸收，所以导致不同种类抗生素在青菜中的富集浓度不同[23]。

　　2.2 不同浓度抗生素在青菜中的累积动态

　　为了探讨鸡粪中不同浓度的抗生素在青菜中的富集动态，试验设置了鸡粪中抗生素初始浓度为10、20、50、100 和 200 mg·kg-1 不同浓度梯度的处理组。在 10 ~ 200 mg·kg-1 处理水平下，青菜中 4 种抗生素的富集浓度皆随着鸡粪中抗生素初始浓度的增大而增大，说明鸡粪中抗生素的初始浓度越大，其中的抗生素在青菜中的富集浓度也越大，健康风险也会越高。不同浓度的抗生素在青菜中富集的规律为 SM2 最高，再依次是OTC、TC 和 SMZ。有研究者发现，在植物体内 SM2的迁移能力大于 SMZ，与本研究结果相同[20]。由于四环素类抗生素水溶性较高，所以极易存在于植物体的细胞质内。

　　2.3 2 种生物炭对抗生素在青菜中累积的阻控效果

　　含抗生素的粪便通过施肥使得菜地土壤被抗生素污染，土壤中的抗生素被蔬菜吸收后，通过食物链威胁人体健康。因此，如何阻控鸡粪或土壤中的抗生素向蔬菜中迁移具有重要的理论与实践意义。为了探究鸡粪中抗生素在青菜中富集的阻控技术，研究了小麦秸秆炭(X)、稻壳炭(D)两种生物炭对鸡粪中 4 种抗生素在青菜中富集的影响。

　　在第 10 天时，添加了生物炭后，青菜中 SMZ 的富集浓度与未添加生物炭的对照相比都有所下降，其中鸡粪中添加小麦秸秆炭的青菜中抗生素富集浓度下降最多，下降率达到88.68%，与对照相比差异显著(P<0.05)，添加稻壳炭的青菜中 SMZ 的富集浓度也比对照有明显的下降(P<0.05)，下降了 69.65%;在第 35 天时，青菜中抗生素逐渐消解，残留浓度在 1.53 ~1.92μg·kg-1 之间，与对照相比，添加两种生物炭的青菜中 SMZ 的残留浓度差异都较小。

　　不同生物炭对SM2 在青菜中富集的影响，第 10 天时，添加小麦秸秆炭和稻壳炭的 2 个处理组青菜中抗生素的富集浓度都显著低于对照，分别降低了 90.98%和 76.70%，但小麦秸秆炭处理组和稻壳炭处理组之间没有明显差异，残留浓度分别为 58.97 和 152.28 μg·kg-1;在第 35 天时，各组中 SM2的残留浓度已低于 2.00 μg·kg-1，相较于 SMZ第 35 天时的浓度低。

　　两种生物炭对四环素(TC)在青菜体内的富集的影响如图 3(c)：第 10 天时，添加小麦秸秆炭和稻壳炭处理下青菜中 TC 的残留浓度在 23.90 和 17.40 μg·kg-1，与 CK 相比有显著降低，分别降低了 86.10%和 89.88%;第 35 天时，青菜体内抗生素富集浓度均低于 10.50 μg·kg-1。青菜中土霉素(OTC)的富集状况见图 3(d)：与 CK 相比，第 10 天时添加小麦秸秆炭和稻壳炭的处理青菜中 OTC 的富集浓度与对照相比都有显著下降，分别下降了 87.87%和 89.34%;第 35 天时，各处理的残留浓度在 0.35 μg·kg-1 以下且差异不显著。

　　综上，青菜移栽后 10 d，两种生物炭均能显著抑制鸡粪中抗生素在青菜中的富集，小麦秸秆炭和稻壳炭对鸡粪中 4 种抗生素在青菜中的富集具有良好的阻控作用，为农业秸秆等废弃物的资源化利用提供了重要途径。

　　2.4 生物炭对土壤中抗生素有效态浓度的影响

　　土壤中抗生素的有效态浓度是指容易被植物吸收的那部分抗生素的浓度。利用 0.1 mol·L-1 CaCl2溶液提取了土壤中抗生素的有效态浓度[24]。无论是上层土壤还是下层土壤，鸡粪中添加生物炭的土壤中抗生素的有效态浓度显著低于鸡粪中未添加生物炭的土壤，这可能是生物炭阻控鸡粪中抗生素在青菜中富集的最主要原因。由于生物炭丰富的多孔隙结构给抗生素提供了大量吸附位点，一部分抗生素被生物炭吸附而无法被 CaCl2 溶液提取，所以使得鸡粪中添加了生物炭的处理组土壤中抗生素的有效态浓度小于相应的未加生物炭处理，阻控了鸡粪中抗生素向青菜中的转移，从而导致青菜吸收抗生素的浓度降低。章明奎等[25]通过土培试验，发现土壤中施用 1.5%和 2.0%生物质炭后，蔬菜中土霉素、恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶和泰乐菌素含量分别比未施生物质炭的对照处理低 7.64%～35.93%。

　　3 结论

　　通过土壤盆栽试验，研究了鸡粪中 4 种抗生素在青菜中的富集动态以及生物炭对富集的影响。结果表明，鸡粪中的抗生素在青菜中富集上升期为第0 至第 10 天，在第 10 天青菜中 4 种抗生素富集浓度达到最高，10 d 后青菜体内抗生素的浓度开始下降，在 24 d 开始趋于平缓。不同种类的抗生素在青菜中的富集能力也不同，在相同添加浓度下，SM2在青菜中的富集浓度最高，OTC、TC 次之，SMZ富集浓度最低。鸡粪中的抗生素浓度越高，青菜中富集的抗生素浓度也就越高，鸡粪中不同浓度的 4种抗生素在青菜中的富集规律相同。在青菜移栽后10 d，鸡粪中添加小麦秸秆炭和稻壳炭可显著降低青菜中 4 种抗生素的富集浓度，且两种生物炭对不同种类抗生素的阻控效果差异不显著，它们在青菜移栽后的10 d可以有效阻控鸡粪中抗生素向青菜中的转移。土壤中抗生素有效态浓度检测表明，鸡粪中添加生物炭后，土壤中抗生素有效态浓度显著降低，这可能是生物炭降低青菜富集抗生素的主要原因。

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　　作者：吴诗颖，王莉莉，李学德*