硅酸钙纳米线复合电纺丝支架的制备及离子释放研究

　　摘要:电纺丝支架已被广泛用于组织工程领域，其中硅酸钙等生物活性陶瓷复合的电纺丝支架，在应用中展现出了优异的生物活性。硅酸钙复合电纺丝支架中硅酸钙降解释放的硅酸根离子(SiO32-)已被证实具有促进成血管性能，但其有效活性离子浓度范围比较窄，仅在0.79~1.8μg/mL之间。因此精确控制组织工程材料的离子释放浓度，使材料释放的离子能较长时间保持在有效活性浓度范围，对于组织工程应用具有重要意义。本研究通过调节电纺丝孔径大小及硅酸钙纳米线的不同复合方式，制备了多种硅酸钙复合电纺丝纤维支架，并比较了其在体外环境下的离子释放模式及对人脐静脉内皮细胞的增殖促进作用。实验结果表明，混纺及同时电喷-电纺复合方式的小孔径硅酸钙复合电纺支架由于高分子的疏水作用和小孔径结构对离子扩散的阻碍，可以实现离子缓释。通过体外细胞实验发现，具有离子缓释效果的支架可以更好地促进人脐静脉内皮细胞的增殖，说明通过调控支架离子缓释，可以有效调控其生物活性，获得最佳组织工程应用效果。

　　关键词:硅酸钙;静电纺丝;可控释放;降解;静电喷雾

　　静电纺丝支架因具有类细胞外基质的三维结构、大比表面积、高孔隙率[1-3]，被广泛应用于血管[4-5]、心肌[6-7]、神经[8-9]等组织工程创伤修复[10]领域。电纺丝支架经过多年的研究发展，通过在其中引入活性药物[11]和活性陶瓷等[12]赋予了电纺丝支架粘附、增殖、迁移、分化等生物活性。硅酸钙等生物活性陶瓷分解释放的SiO32-，不仅被证实具有促进骨[13]、牙齿[14]等硬组织再生的作用。

　　近年来陆续发现SiO32-还具有促进血管[15]、脂肪[16]、皮肤创面[17]、毛囊[18]、心肌[19]等多种软组织修复的生物活性。前期研究中，硅酸钙等生物活性陶瓷通过混纺[19]或者喷涂[20]的方式与电纺丝进行复合，促进了组织的修复。但是，不同的组织修复所需的活性SiO32-浓度范围各有差异[21]，以促进成血管性能为例，据Li等[22]报道，SiO32-有效促进成血管的浓度范围为0.79~1.8μg/mL，有效浓度范围较窄，这对于材料中SiO32-的释放行为提出了要求。

　　虽然前述工作报道的硅酸钙等生物活性陶瓷复合电纺丝支架中释放的SiO32-具有促进软组织修复的作用，但并未关注材料中SiO32-的释放行为对于软组织修复效果的影响。因此，精确控制组织工程材料中硅酸盐陶瓷降解产生的SiO32-的释放行为具有重要意义。 前期的研究[23-25]表明，孔径的大小对材料内部的药物释放有重要影响，因此本研究提出的第一个假设是，通过调节电纺丝的孔径结构可以有效调控生物活性离子的释放行为。

　　此外，医用电纺丝支架常用的高分子主要有聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)等疏水性高分子，有文献[26]报道这些疏水性高分子的疏水作用将阻碍内部药物释放，因此本研究提出第二个假设是，硅酸钙在复合材料体系内的分布位置不同，如纤维丝内部、纤维表面均匀分布、集中分布于支架外表面、“三明治”夹心层等，将会导致复合材料中硅酸钙受到的高分子疏水作用有所不同，从而影响SiO32-的释放行为。基于以上假设，本研究考虑可以通过调控硅酸钙/高分子复合组织工程材料的孔径及硅酸钙颗粒在复合材料中的位置来调控SiO32-释放。

　　因此，本研究制备了不同孔径复合电纺丝支架，并结合静电喷雾技术，构建了多种硅酸钙复合形式的电纺丝支架，探讨了孔径及复合形式对于材料亲疏水性及离子释放的影响，并在此基础上考察了复合支架的不同离子释放行为对于血管内皮细胞的影响。

　　1实验方法

　　1.1实验试剂

　　本研究采用的药品四水合硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)、九水合硅酸钠(Na2SiO3·9H2O)、明胶购于中国医药集团上海化学试剂有限公司;聚乳酸(PLA，分子量6万)购于济南岱罡生物工程有限公司，聚己内酯(PCL，分子量8万);六氟异丙醇(HFIP)购于Sigma-Aldrich公司。

　　1.2硅酸钙纳米线的制备与表征

　　根据文献[27]报道，采用水热法合成硅酸钙纳米线(Ca6(Si6O17)(OH)2，CSH)。即，将9.446g的Ca(NO3)2·4H2O和11.368g的Na2SiO3·9H2O分别溶解于100mL的去离子水中，磁力搅拌1h后，将混匀的溶液转移至水热釜中200℃反应24h。待水热釜自然冷却后，将制得的CSH用去离子水和乙醇分别冲洗三次，于60℃烘箱中烘干24h备用。采用18kW转靶X射线衍射仪分析CSH的物相组成;使用场发射透射电子显微镜(JEM-2100F)观察纳米线的结构。

　　1.3不同孔径电纺丝的制备

　　本研究通过调节高分子电纺丝(Electrospun,ES)溶液的浓度调节电纺丝孔径的变化。即，配方将不同质量的PLA、PCL、明胶以35/35/30(w/w/w)的比例溶解于HFIP中，将电纺丝溶液置于磁力搅拌器上以120r/min的速度搅拌48h直至澄清，分别得到浓度(w/v)为5%、10%、18%、22%的电纺丝溶液，分别命名为5ES、10ES、18ES、22ES。随后各溶液分别转移到20mL注射器中进行静电纺丝。

　　由于不同浓度的电纺丝溶液的纺丝液性质不同，为能制备到形态良好的电纺丝纤维，本研究对电纺丝的电压、流速、针头与基板的间距均进行了相应的调节，其中各组溶液的电压、流速、针基板间距等纺丝参数进行设置：对各组电纺丝SEM照片采用ImageJ软件测量50根以上的纤维，并统计分析得到其直径和孔径[28]，通过测量50个以上由纤维围成的孔的尺寸，并统计分析得到其孔径。

　　1.4硅酸钙复合电纺丝支架的制备与表征

　　本研究通过四种不同方式制备硅酸钙复合电纺丝支架：(a)混纺CSH;(b)电纺丝的同时电喷CSH;(c)在电纺膜表面电喷CSH;(d)表面喷有CSH的电纺膜再进行电纺丝。四种方法制备的电纺丝支架，分别命名为CSH@ES、CSH&ES、CSH//ES、ES/CSH/ES。具体制备方法如下。(a)CSH@ES：将0.05gCSH加入到10mL5ES或22ES电纺丝溶液中，分别以5ES或22ES的电纺丝参数进行混纺而制得;(b)CSH&ES：在制作10mL5ES或22ES电纺丝的同时静电喷雾10mL含0.05g的CSH乙醇溶液而制得，其中电喷参数设定为电压18kV及针基板间距15cm。

　　(c)CSH//ES：在制作10mL5ES或22ES电纺丝后，于纤维膜表面采用前述静电喷雾条件电喷10mL含0.05g的CSH乙醇溶液而制得;(d)ES/CSH/ES：在制作5mL5ES或22ES溶液电纺丝后，在纤维膜上电喷10mL含0.05g的CSH乙醇溶液，之后再作5mL5ES或22ES溶液电纺丝，形成以CSH为夹心层的“三明治”纤维膜结构。上述制备过程中，通过控制掺入或电喷相同含量的CSH以保证各组的CSH含量一致。硅酸钙复合支架的接触角表征通过水接触角分析仪(FM40Mk2Easydrop)进行测试;利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测支架在细胞培养液中浸泡1、3、5、7d的SiO32-释放行为。

　　1.5细胞实验

　　本研究中采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC，购自中科院细胞库)研究硅酸钙复合电纺丝支架对细胞的增殖影响。将HUVEC种于纤维支架表面，并培养于37℃、含5%二氧化碳空气的细胞培养箱中，隔天更换细胞培养液。在预设时间点1、3、7d时采用CellCountingKit-8(CCK8，Japan)试剂盒对细胞活性进行检测。为了观察HUVEC在材料上的粘附效果，将培养1、3d后的细胞样品培养液吸出，并用4%多聚甲醛固定30min后，采用荧光素异硫氰酸酯(FITC)-鬼笔环肽浸泡材料上的细胞30min以染色细胞骨架，用DAPI浸泡10min以染色细胞核，之后在激光共聚焦显微镜下观察细胞形态。

　　2结果与讨论

　　2.1CSH的组成与形貌

　　本研究通过水热法成功制备了硅酸钙纳米线。通过XRD对CSH的物相进行了表征并与标准卡片PDF#23-0125(Ca6Si6O17(OH)2)比较，结果显示CSH的主要峰位均与Ca6Si6O17(OH)2保持一致。水热法制备的CSH纳米线具有一维结构，平均直径约20nm，长度3~7μm。

　　2.2不同孔径的电纺丝形貌

　　在未复合硅酸钙纳米线的情况下，通过调节电纺丝溶液浓度与电纺丝参数，分别制备了不同结构的电纺丝纤维。随着电纺丝溶液浓度的增大并相应调节电压、流速、针头与基板等电纺丝参数后，可看出所制得的纤维直径和相应的孔径都逐渐增大。 进一步对电纺丝作纤维直径与孔径的测定和统计分析表明，纤维直径与孔径最小的5ES组，其纤维直径和孔径分别为0.24和0.68μm;纤维直径与孔径最大的22ES组，其纤维直径和孔径分别为10.27和50.46μm。后续实验将采用孔径最小的5ES和孔径最大的22ES(分别命名为小孔径组和大孔径组)探索孔径对离子释放的影响。

　　2.3硅酸钙复合电纺丝支架的形貌特征及润湿性能

　　本研究通过将电纺丝溶液与CSH进行混纺制备了CSH@ES，在电纺丝纤维的同时电喷CSH颗粒，制备得到了CSH&ES，在已纺纤维表面电喷CSH颗粒制备了CSH//ES，在表面电喷了CSH的电纺丝表面再纺丝一层构建CSH的夹心“三明治”结构得到ES/CSH/ES。混纺的CSH@ES的电纺丝纤维表面光滑，无肉眼可见的CSH纳米线分布于纤维表面，但通过TEM观察可知，CSH均匀分散于纤维丝内部。

　　由于电喷过程中，喷出的液滴中乙醇溶剂不断挥发，CSH纳米线发生团聚，最终在基底上形成CSH团聚体颗粒。同时电喷-电纺的CSH&ES，颗粒均匀分布于整个电纺丝支架体系内，CSH团聚体颗粒不仅分布于支架表面，还大量被电纺纤维缠绕镶嵌于纤维支架中。而CSH//ES中，大量CSH团聚体颗粒因静电作用均匀吸附于电纺丝纤维表面，展示了CSH//ES支架表面的CSH团聚体颗粒的放大照片，可以看到颗粒由大量细小的纳米线团聚而成，其直径在1~2μm。而“三明治”结构的ES/CSH/ES，因CSH位于夹心层位置，表面仅可观察到光滑的电纺丝，无明显的CSH暴露。

　　纳米材料评职知识：纳米化学论文参考文献

　　3结论

　　本研究采用硅酸钙高分子复合电纺丝膜材料研究了复合材料释放SiO32-规律及其细胞生物学效应，可以得出如下结论：1)通过调节电纺丝溶液浓度获得了不同孔径大小的电纺丝支架;通过静电纺丝与静电喷雾技术的不同组合方式，制备得到了具有不同分布特点的硅酸钙纳米颗粒/高分子复合电纺丝材料;2)在相同陶瓷颗粒分布的情况下，电纺丝支架孔径越小，离子释放越缓慢;3)电纺丝支架在具有相同孔径的情况下，硅酸钙纳米线分布于纤维丝内部或被纤维丝紧密缠绕在支架内部的复合电纺丝材料，由于疏水高分子包裹效应导致离子释放缓慢，具有缓释特性;4)具有离子缓释作用的小孔径混纺及同时电纺-电喷陶瓷/高分子复合电纺丝材料可有效促进内皮细胞的增殖。

　　5)本研究通过调节孔径和CSH的复合方式，发现小孔径及混纺或同时电喷-电纺的复合形式对于离子缓释效果最佳，验证了其在促进细胞增殖方面的优势，有望为新型创伤敷料的开发提供参考。但是，体内的液体动态流动环境与体外模拟的液体环境存在较大差别，复合支架在体内的最佳促修复离子释放浓度也与体外存在一定差异，本研究得出的上述组织工程复合支架材料的规律还有待动物实验的验证。

　　参考文献

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　　作者：包峰1,2，常江1,2