鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的清除效果研究

　　摘要：目的：比较食品工业中常用的消毒剂、常用的防腐剂及几种天然成分对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellayphimurium)生物被膜的影响。方法：通过在培养过程中添加不同种类、不同浓度的清除剂，测定所选清除剂对生物被膜形成过程的影响;用所选的清除剂对成熟生物被膜进行浸泡处理，评估每种清除剂不同含量下的清除效果;利用MTT法测定经不同清除剂处理后生物被膜菌内细胞的代谢活性;采用稀释平板涂布法计算不同物质处理后生物被膜内细菌的存活数。结果：消毒剂乙醇(50%)、过氧化氢(1%)、苯扎氯铵(0.6%)、苯扎溴铵(0.6%)，天然成分香芹酚、肉桂醛和百里香精油(1.0μL/mL)在较低浓度下即可有效抑制S.typhimuriumCDC3和S.yphimuriumST34生物被膜的产生;消毒剂洗洁精、过氧化氢和天然成分香芹酚、肉桂醛和百里香精油在清除成熟生物被膜方面表现出了一定的优势，其中清除效率最理想的是过氧化氢，最大可达90%左右，洗洁精最大清除率可至80%，香芹酚、肉桂醛和百里香精油可达70%左右;消毒剂乙醇、苯扎氯铵和苯扎溴铵，以及天然成分香芹酚、肉桂醛和百里香精油可以明显降低生物被膜菌的细胞代谢活性及活菌存活数，可将生物被膜内活菌数降低个log值。结论：对于成熟生物被膜的清除，在初始的培养中添加清除剂或是天然成分可以更加完全有效的控制生物被膜的产生。

　　关键词：鼠伤寒沙门氏菌，生物被膜，消毒剂，食品防腐剂，天然成分，抑制作用，清除效果

　　鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一，是目前世界各国分离率最高的菌型之一[1]。它能引起各种家禽和哺乳动物的传染病，也可造成人类感染，对食品安全和公共卫生具有重要的影响[2,3]。在食品工业中，S.typhimurium常以生物被膜的形态存在于加工器械表面。生物被膜(biofilm)是一种复杂的多糖蛋白复合物，它由附着在接触面的细菌以及细菌分泌的胞外聚合物(EPS)组成。一旦生物被膜形成之后，菌体对宿主免疫系统的抵御能力增强，对常用的消毒剂、抗生素等也表现出更强地耐受性[46]。

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　　与浮游细菌相比，生物被膜菌对各种杀菌剂和环境变化的敏感性大大降低，对抑菌成分的耐受性也更强，这使得清除食品加工设施上的生物被膜成为一个巨大的挑战[7,8]。S.typhimurium生物被膜的形成往往在固液相交界处，是一个动态的过程。生物被膜形成初始时，菌体在固体接触面附着，随着细菌生长繁殖，菌体数量逐步增大。当菌体达到一定浓度时，细菌感应到浓度信号，生长状态开始变化，多糖、胞外蛋白等开始合成，逐渐形成成熟的生物被膜[9,10]。

　　当菌体感应到外界环境适应时，生物被膜脱落使菌体暴露而重新游离，直至遇到新的条件而再次形成生物被膜，如此往复，对食品工业造成较大困扰[11,12]。目前对于生物被膜的控制方法主要包括以下几种：物理法、化学法和生物法。物理法有超声波法、电击法和紫外照射等;化学方法主要是指一些化学消毒剂、表面活性剂和金属螯合物等;生物法目前研究主要集中于抗生物及其衍生物、抗菌药物联合使用、天然产物等[13,14]。其中物理法中研究较多的是超声波处理和紫外照射，李燕杰等[15]用超声波对单核增生李斯特菌生物被膜进行处理，得出当超声功率为250、温度35℃和时间min时，被膜清除率可达到96.34%的结论;翟立公等[16]的研究发现：―84‖消毒液、过氧化氢、―果蔬净‖对生物被膜都有清除作用，可以使部分生物被膜脱落。

　　―84‖消毒液对生物被膜中菌体的杀菌效果最好;过氧化氢只有高浓度时可以杀灭生物被膜中的菌;―果蔬净‖几乎没有杀菌作用。常冰雪[17]用乙醇、洗洁精和过氧化氢对铜绿假单胞菌生物被膜进行处理发现，过氧化氢具有很好的清除效果，在实验设置最高浓度(6%)下能清除超过50%的生物被膜。―84‖消毒液在有效氯含量在256μg/mL时仅能清除20%左右的生物被膜。这说明不同种属的菌株可能对消毒剂或是抑菌物质的耐受性是不同的。近几年对生物被膜的控制研究多集中于天然植物提取物或是生物制剂方面。如戴雨芸等[18]发现香芹酚对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制和生物被膜的清除均有较强作用效果。

　　朱军莉等[19]的实验结果表明随着茶多酚和葡萄籽提取物作用质量浓度增加对假单胞菌生长和生物被膜的抑制作用增强，但在清除成熟生物被膜方面没有较好的作用。王琳等[20]的研究结果显示金银花提取物和蒲公英提取物可以破坏假单胞菌生物被膜结构，从而清除生物被膜，并且清除效果随质量浓度的增加而逐渐增强。本研究分别选取了食品工业常用的几种消毒剂、食品工业常用的食品防腐剂以及几种天然成分。从对S.yphimurium生物被膜的形成过程及清除效果着手，评估各类清除剂在控制S.typhimurium生物被膜方面的优劣势，可以为食品工业中该类菌株生物被膜的控制提供一定的参考。

　　1材料与方法

　　1.1材料与仪器

　　鼠伤寒沙门氏菌S.typhimuriumCDC3由南京疾病预防与控制中心赠与;鼠伤寒沙门氏菌S.yphimuriumST34南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保存菌株。菌株在含有25%甘油的冻存管中于80℃冰箱中冷冻保存。MTT(噻唑蓝)、苯扎氯铵、苯扎溴铵、香芹酚、肉桂醛、双乙酸钠、乳酸钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素上海麦克林试剂公司;茶多酚、百里香精油上海源叶生物科技公司;结晶紫粉末、无水乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)国药集团;十二烷基磺酸钠(SDS)北京索莱宝科技有限公司。

　　TryptoneSoyBroth(TSB)培养基：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，葡萄糖2.5g，磷酸氢二钾2.5g，去离子水1000mL，pH7.07.5，115℃灭菌30min;LuriaBertani(LB)培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，pH7.07.5，121℃灭菌20min;0.5%结晶紫配制方法：结晶紫2.5g，草酸铵4g，95%乙醇100mL，400mL去离子水，超声至完全溶解后备用。Multiskan™FC多功能酶标仪、T1300Ⅱ级生物安全柜赛默飞世尔科技公司;SX700高压蒸汽灭菌锅日本Tomy公司;SB5200DT超声波清洗仪宁波新芝生物科技股份有限公司;AY120电子天平日本岛津公司;TDL802C低速台式离心机上海安亭科学仪器厂;DRP9162恒温培养箱上海森信实验仪器有限公司。

　　1.2实验方法

　　1.2.1菌株的活化与培养

　　取80℃冻存的菌株S.typhimuriumCDC3和S.typhimuriumST19接种于TSB液体培养基中37℃180r/min条件下活化两次，然后接种于TSA平板上，挑取单菌落接种于新鲜的TSB培养基中37℃180r/min过夜培养，备用。

　　1.2.2不同清除剂浓度的确定根据中华人民共和国国家标准GB27602014中明确规定的各类食品添加剂的限量标准，以此确定各类清除剂的添加比例及浓度44。根据各类添加剂的限量标准，配制相应的母液浓度，苯甲酸钠，山梨酸钾，SDS，EDTA，双乙酸钠，乳酸钠等121℃，灭菌20min;苯扎氯铵，苯扎溴铵，百里香精油，香芹酚，肉桂醛，茶多酚，洗洁精，―84‖消毒液，无水乙醇，30%过氧化氢等用0.22μm滤膜过滤除菌后备用。

　　1.2.3不同清除剂对S.typhimurium生长及生物被膜形成的影响将已进行无菌处理的清除剂(消毒剂：洗洁精、、无水乙醇、苯扎氯铵、苯扎溴铵、EDTA和SDS;食品防腐剂：苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸钠和双乙酸钠;天然成分物质：香芹酚、肉桂醛、百里香精油、茶多酚和乳酸链球菌素)在原浓度的基础上进行梯度稀释，以SDS为例：SDS原浓度为1%，用TSB液体培养基将其依次稀释至0.1%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1%。将两株S.yphimurium以1%的接种量分别接种于上述稀释好的溶液中，然后吸取200μL液体接种于96孔聚乙烯板中。每个处理设置三个平行，并设置阴性对照(只添加TSB液体培养基)和阳性对照(添加TSB液体培养基并接种1%的S.yphimurium)。

　　于37℃恒温培养箱中静置培养48后，观察不同浓度的添加剂处理后生物被膜的形成情况并测定OD600nm处的吸光度值，然后采用结晶紫染色法对生物被膜进行定量测定。结晶紫染色法的操作步骤参考PrattL[21]和杨维青等人[22]的方法，具体如下：弃去96孔板中多余培养基，用无菌水漂洗~4次后晾干，待完全干燥后向孔中加入200μL0.5%的结晶紫染色液;于室温下染色30min，染色完毕后弃去全部染色液，用无菌水漂洗次洗去浮色;待完全晾干后向每孔加入200μL95%的乙醇，室温下放置15min;用多功能酶标仪测定每孔在OD595nm处的吸光值，即为孔内生物被膜的生成量。同时每个处理设置空白对照，即只含TSB液体培养基不接菌液。

　　1.2.4不同清除剂对S.typhimurium生物被膜的清除效果评估

　　将两株S.yphimurium以1%的接种量接种于TSB液体培养基中，然后吸取200μL液体接种至96孔聚乙烯板中。每个处理设置三个平行，并设置阴性对照(只添加TSB液体培养基)和阳性对照(添加TSB液体培养基并接种1%的S.yphimurium)，于37℃恒温培养箱中静置培养48。

　　采用1.2.3中所述的结晶紫染色法测定每孔OD595nm处吸光值，即为孔内生物被膜的生成量，通过以下公式计算可得每种清除剂对生物被膜的清除率。清除率的计算公式为：清除率(%)=(X1X)/X1×100%其中X1为阳性对照，即不经处理时鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的形成量;为经过处理后S.yphimurium生物被膜的形成量。

　　1.2.5MTT法测定不同清除剂处理后yphimurium生物被膜态细胞的代谢活性采用MTT法对不同清除剂处理后生物被膜内细菌的相对代谢活性进行测定，具体操作步骤参考Gerlier等[23]和杨翠云等[24]的方法并稍作改动。采用1.2.4中所述的方法培养并处理生物被膜，经不同清除剂处理完毕后，无菌水清洗晾干。然后向每个孔内分别添加100μL的TSB液体培养基和100μL的MTT溶液(mg/mL)，于37℃恒温培养箱中避光孵育。小心弃去孔中的MTT及培养基混合液，然后用无菌水清洗除尽孔中的残液。晾干后向每个孔内添加200μL的DMSO(二甲基亚砜)试剂，37℃静置1520min，用酶标仪测定其在OD490nm处的吸光值，即得每个孔内细胞的相对代谢活性。

　　1.2.6不同清除剂处理后S.yphimurium生物被膜菌的活菌数菌落计数法检测生物被膜中活菌数具体方法参考梁瑞[25]所描述的方法。生物被膜的培养及处理方法1.2.4中所述，经不同清除剂处理完毕后，用无菌水洗尽残液并晾干。之后，向每个孔内添加200μL生理盐水用细胞刮刀将黏附在底部和孔壁的生物被膜刮下并溶解在生理盐水中。最后将200μL溶有生物被膜菌的溶液转移到1.5mL的无菌离心管中，对其依次进行十倍梯度稀释，然后涂布于LB固体培养基中，于37℃恒温培养箱中倒置培养24后进行菌落计数，然后计算经不同清除剂的不同浓度处理后两株S.typhimurium生物被膜菌的活菌数。每组处理均设置三个平行。 每组实验重复三次，实验数据处理用平均值标准偏差(eans±SD)表示，利用GraphadPrism9.0作图软件对数据进行整理和分析。

　　2结果与分析

　　2.1不同清除剂对S.yphimurium生物被膜形成的影响

　　2.1.1食品工业常用消毒剂对S.yphimurium生物被膜形成的影响从食品工业用消毒剂中选取了其中种比较常见的消毒剂及抑菌成分，根据国家食品卫生标准中推荐的每种消毒剂的使用比例及最高浓度为参考。在两株S.typhimurium培养的过程中，分别将每种消毒剂以不同浓度添加到培养基中，测定不同消毒剂对细菌生长及生物被膜形成的影响。

　　由以上结果可以得出：几种常用消毒剂对生物被膜形成过程的抑制作用主要是通过抑制细菌菌体生长的方式实现的。八种消毒剂对两种鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的影响趋势基本是一致的，乙醇、过氧化氢、苯扎氯铵和苯扎溴铵在低浓度下即可基本抑制生物被膜的形成;“84”消毒液、SDS在较高浓度下才对两种鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的形成产生抑制效果;而洗洁精、EDTA即使在高浓度下抑制效果也理想。

　　2.1.2食品工业常用食品防腐剂对S.typhimurium生物被膜形成的影响

　　食品工业用化学防腐剂已被证实在一定剂量及时间内可以防止食品的腐败变质并且是安全的。本次研究选取了食品中常用的四种防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾、双乙酸钠和乳酸钠，根据国家食品安全标准中对食品添加剂使用剂量的规定，针对每种防腐剂设置个不同浓度，比较四种防腐剂对S.yphimuriumCDC3和ST34生物被膜形成的影响。

　　2.2.1食品工业常用消毒剂对S.typhimurium生物被膜的清除效果

　　在S.typhimuriumCDC3和.typhimuriumST34形成生物被膜后，利用上述实验中选取的八种消毒剂在不同浓度下对成熟的生物被膜进行浸泡处理，然后测定处理前后生物被膜的变化。

　　通过结晶紫染色法测定不同消毒剂浸泡处理前后S.typhimuriumCDC3和S.TyphimuriumST34生物被膜在OD595nm处吸光值的变化，以阳性对照为参考，可计算得出每种消毒剂在不同浓度下对生物被膜的清除率。这八种消毒剂对S.typhimuriumCDC3和S.typhimuriumST34生物被膜的清除效果。由中可以看出，乙醇和SDS对生物被膜的清除效果最高才达20%，而且随着浓度的变化，生物被膜的减少量几乎没有太大变化。―84‖消毒液在较高的比例下如∶100或∶50时，对生物被膜的清除率可以达到80%左右，但有效氯成分含量较高时会对人体具有一定的刺激性，因而不是较好的生物被膜清除剂选择。

　　洗洁精随着浓度的增加，清除效果呈上升的趋势。过氧化氢在含量为1%时对.typhimuriumCDC3和S.typhimuriumST34的清除率分别可达到50%和65%左右，当其含量达到6%时，清除率可高达90%。而EDTA、苯扎氯铵、苯扎溴铵的清除效果随着浓度的增加呈逐步上升的趋势，在高浓度下可达到60%左右。在八种消毒剂中，清除效果较好的是过氧化氢，其在低浓度下即可基本达到其它几种清除剂的效果。

　　2.2.2食品工业常用食品防腐剂对S.typhimurium生物被膜的清除效果

　　苯甲酸钠和山梨酸钾是食品工业中最常用的两种食品防腐剂，而双乙酸钠和乳酸钠则经常被用于禽肉制品中，禽肉制品又是S.yphimurium主要的寄主之一。四种防腐剂根据国标规定的使用剂量，在生物被膜成熟之后对其进行浸泡处理，测定生物被膜的生成量。

　　食品工业用消毒剂过氧化氢和“84”消毒液为强氧化剂，在加入过氧化氢后，孔内的生物被膜立即开始溶解，也即说明生物被膜中的成分与强氧化剂过氧化氢发生了反应，从而使大量的生物被膜溶解[29,30]，而“84”消毒液只有在高浓度下才有此效果;苯扎氯铵、苯扎溴铵则均为阳离子表面活性剂，可以和生物被膜中游离的部分自由基结合，从而降解部分生物被膜，洗洁精的主要成分物质也是表面活性剂，可以溶解、分散生物被膜中的部分物质，从而达到清除生物被膜的效果[31,32]。

　　而食品防腐剂主要是通过抑制破坏或损伤微生物的细胞壁或细胞膜而抑制其生长，而成熟生物被膜具有致密的膜状结构，导致防腐剂不能发挥更好的清除作用[33,34]。而天然成分物质多是萜类、酚类及醛类物质，这些物质可以分散或是破坏成熟生物被膜的结构，从而清除部分生物被膜，具体破坏生物被膜结构的机制还需进一步的探索[26]。

　　在所有选择的三大类清除剂中，乙醇、过氧化氢、苯扎氯铵和苯扎溴铵这四种食品工业用消毒剂可以较好的抑制生物被膜内细胞的代谢活性，且可以大大降低被膜内的活菌数;种食品防腐剂处理后对于生物被膜内细胞代谢活性和活菌数有一定的影响，但效果不是很显著;另外，香芹酚、肉桂醛和百里香精油在杀灭生物被膜内活细胞方面也有很好的效果，乳酸链球菌素几乎不抑制沙门氏菌的生长。

　　结论与讨论

　　本研究分别选取了食品工业上常用的几种化学消毒剂：乙醇、―84‖消毒液、洗洁精、苯扎氯铵和苯扎溴铵，另外还有金属螯合剂EDTA和表面活性剂SDS;食品加工中常用的四种防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾、双乙酸钠及乳酸钠;最后又选择了几种天然成分物质：香芹酚、肉桂醛、百里香精油、茶多酚以及抗菌物质乳酸链球菌素。以S.typhimuriumCDC3和S.yphimuriumST34为研究对象，分别从对生物被膜形成过程的影响、对成熟生物被膜的清除效果、以及不同物质处理后生物被膜菌内细胞的代谢活性及活菌存活数这四个方面，评估了这些物质在鼠伤寒沙门氏菌生物被膜控制方面的作用效果。

　　可以得出以下几个结论：首先，化学消毒剂乙醇、苯扎氯铵、苯扎溴铵在较低浓度下即可有效的抑制S.typhimuriumCDC3和S.typhimuriumST34生物被膜的形成，并且对成熟的生物被膜浸泡处理后，可以大大降低其内细胞的代谢活性及活菌数，不过在清除成熟生物被膜方面，较为理想的是过氧化氢，当其浓度达到6%时，对生物被膜的清除率可达到90%左右。本研究中，苯甲酸钠、山梨酸钾和乳酸钠在高浓度下对两株S.typhimurium的生物被膜形成有较明显的抑制作用，但低浓度下效果不好，而双乙酸钠则几乎没什么作用。谢丽斯等人[35]用山梨酸钾和苯甲酸钠对金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程的影响进行研究，得出了在添加低质量浓度防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠后，金黄色葡萄球菌成膜能力也受到抑制的结论，这和本研究所得出的结论稍有不同。

　　在对成熟生物被膜清除的实验中发现，防腐剂的清除效果很弱，较高浓度下才有发挥一定的清除作用。四种食品防腐剂处理.typhimuriumCDC3和S.typhimuriumST34生物被膜后，对其内的细胞代谢活性进行检测发现随着防腐剂浓度的增加，被膜内细胞的活性降低，再通过平板稀释涂布法定量检测活菌数时，发现活菌数的下降程度也不明显，也即防腐剂处理后，细胞活性的降低只是使沙门氏菌进入了休眠状态，并没有完全杀灭细菌，一旦条件合适，细菌即可继续生存。

　　在几种天然食品添加剂中，比较理想的是肉桂醛、香芹酚和百里香精油，这三种物质在低浓度下可基本抑制生物被膜的产生。这与戴雨芸等人[18]所研究的香芹酚对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制，张文艳等[36]研究的肉桂醛对食源性致病菌金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌生物被膜的形成有抑制作用的结果是一致的，Niu等[37]也发现肉桂醛可以通过杀死细菌来有效抑制.coli生物被膜的形成，在本研究中也发现，添加剂可以通过抑制菌体的生长而抑制生物被膜的产生。当这三种天然食品添加剂作用于成熟生物被膜后也可有效杀死生物被膜内的活菌数。目前关于天然成分物质对生物被膜形成的抑制机理主要涉及抑制细菌菌体的生长、抑制群体感应系统，以及抑制生物被膜中胞外多糖和胞外蛋白的合成等方面。

　　植物精油的成分复杂，一种精油通常由几十种到几百种化合物组成，主要为萜烯类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮化合物等小分子简单化合物[38]。已有很多研究证明天然植物精油中的主要成分是比较理想的群体感应抑制剂，群体感应抑制剂只是轻微抑制或不抑制细菌的生长，不会细菌的生长造成压力[26,39]。有研究表明芳樟醇不仅能抑制细菌的群体感应系统，还具有杀菌作用，芳樟醇可以破环铜绿假单胞菌的生物被膜，导致核酸外泄，杀灭细菌[40]。另有研究发现，低浓度的大蒜活性化合物在不影响铜绿假单胞菌生长的情况下，抑制该菌QS系统调控的毒力因子的产生，并且抑制生物被膜的形成以及群集运动[26,41]。

　　此外，天然植物成分还可通过抑制或降解生物被膜基质的主要成分来抑制生物被膜的形成。如程锋等[42]发现茶树精油可通过抑制agr、ica、cid及sarA等种基因的表达，抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程中eDNA的释放以及PIA的合成，降低了生物被膜的黏附性，从而表现出抗生物被膜活性。而在本研究中发现香芹酚、肉桂醛和百里香精油可抑制细菌菌体的生长使菌体产生物被膜能力下降。如Klan等也发现牛至中的香芹酚可通过降低变形链球菌的代谢活性以抑制生物被膜的形成。对于香芹酚、肉桂醛和百里香精油对本研究中鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成产生抑制的具体影响机制还需进一步的研究探索。

　　根据以上的结果，我们可以总结出，不管是何种物质在清除成熟生物被膜时都没有达到100%的效果，这就可能会使得残留的生物被膜中微生物继续生长，导致加工环境或者产品受到再次污染。经不同材料处理后虽然有些物质表现出了较好的杀生物被膜菌的效果，但还是会有少部分细菌被生物被膜包裹起来而增强了对外界环境的耐受力，这也会是一个安全隐患[43]。控制生物被膜污染的最适宜的方法是在初始培养前，加入抑菌物质，抑制细菌菌体的生长，从而有效地控制生物被膜的形成。

　　本研究共选取了17种清除剂，分别是食品工业常用的种消毒剂、常用的种食品防腐剂以及种天然食品添加剂，分别从四个方面系统比较了它们对生物被膜的控制及清除效果，发现过氧化氢不仅可以有效抑制S.typhimurium生物被膜的形成，对成熟生物被膜的清除也具有较好的效果，这对于食品工业中控制鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的污染具有一定的参考意义。此外，在生物被膜形成的初始阶段控制生物被膜的污染是最为有效的。

　　目前，国内对于生物被膜的控制研究多是集中在革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等和革兰氏阴性菌如副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌等，针对沙门氏菌尤其是S.typhimurium生物被膜的控制及清除研究报道的还较少。即使有报道，也只是单一的选取一种清除剂，并没有系统地比较多种清除剂或是不同控制方法的清除效果。本研究选取的清除剂涉及种类多、涵盖范围广，可以为寻找有效控制生物被膜污染提供一个思路。

　　参考文献

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　　作者：郑丽平，陆兆新，孔梁宇，胡安妥，孟凡强，别小妹