黄瓜铜伴侣蛋白基因CsATX1克隆及表达分析

　　摘要我国黄瓜品种繁多，但黄瓜的抗逆性不强，容易产生病虫害。因此，分析和验证抗病相关的基因，探究黄瓜抗病的分子机理，可为培育黄瓜抗性品种奠定基础。本研究以黄瓜为试验材料，采用RT-PCR技术克隆了黄瓜铜伴侣蛋白基因CsATX1的cDNA序列全长，并对其进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR的方法分析CsATX1基因在细菌性角斑病侵染0~96h下的表达情况，以期探究其与黄瓜抗病性的关系。结果表明：CsATX1基因序列全长为768bp，含有一个288bp的ORF阅读框，可编码95个氨基酸，该基因编码蛋白的相对分子质量约为9.95kD，理论等电点是5.07，为亲水性蛋白，不具有跨膜结构，不含信号肽序列。系统进化树分析表明CsATX1与葫芦科同源蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明，CsATX1在黄瓜叶中有表达，在黄瓜细菌性角斑病菌侵染下，该基因在黄瓜叶中表达显著增高，受黄瓜细菌性角斑病菌的诱导。该研究结果为深入探究CsATX1基因功能提供科学依据。

　　关键词黄瓜;铜伴侣蛋白;基因克隆;细菌性角斑病;荧光定量PCR

　　铜(Cu)是植物生长发育所必需的微量元素，在正常生理条件下，主要以两种离子形式存在：Cu+和Cu2+，且这两种Cu的状态可以相互转换，这一特点使得Cu能够作为细胞内的辅助因子来参与植物体内一些重要的氧化还原反应(袁金红等,2016)，如在光合作用、呼吸作用、氧化胁迫防御等生理活动中发挥重要功能(Yruela,2009)，植物中铜含量为2~50μg/gDW(dryweight)，当植物中铜水平低于正常值时，植物开始表现缺铜症状，如生长缓慢、幼叶失绿、叶缘卷曲、果实形成减少等;而铜离子含量过高则会对植物产生毒害(Laliotietal.,2009)，主要表现为：根系生长受阻，新叶失绿、老叶坏死，叶柄和叶背变为紫色等。维持细胞内铜离子稳态是通过一系列的转运蛋白和金属结合蛋白来完成的(Lengetal.,2015)。

　　农业论文投稿刊物：《湖北农业科学》创刊于1955年，以学术性、科学性和实用性为特色，主要报道国内外农业最新科技成果和科研动态，传播科技信息。主要栏目有：综述、硒谷论坛、育种·栽培、资源·环境、植物保护、园艺·特产、畜牧·兽医、水产养殖、贮藏·加工、检测分析、农业工程、信息工程、生物工程、经济·管理、乡村振兴等。本刊为半月刊，上下半月分别于每月10日、25日出版。欢迎广大作者针对各栏目特色踊跃投稿。见刊后，我们给每文作者提供2本样书和10份独立文章的单行本，以快递形式送达。

　　铜伴侣蛋白可与铜离子进行结合，其含有铜离子结合区，是一类低分子量的金属传递蛋白，通过将铜离子向靶位点转移和运输，以达到平衡细胞内铜离子的量进而避免其产生毒害的目的(卫浩等,2019)。铜伴侣蛋白首先在酿酒酵母中被发现(LinandCulotta,1995)，对ATX1基因功能的研究表明它参与转运铜离子，并证明这一过程可以有效阻止氧自由基进一步对细胞的破坏作用。植物中有ATX1-type和CCH-type两种ATX-like铜伴侣蛋白。研究表明铜离子可以调控铜伴侣蛋白的表达量(PuigandThiele,2002)，同时研究还发现在拟南芥中过表达ATXlike基因后可起到降低铜离子胁迫的作用。

　　此外，研究其他植物ATX-like铜伴侣蛋白发现该蛋白可能具有不同的功能，如水稻ATX基因不仅受水杨酸、脱落酸、茉莉酸等激素诱导，而且也可以响应Cu+和病原菌(Magnaporthegrisea)的诱导，该结果表明铜伴侣蛋白可能在植物抵御不良环境或病原菌的侵害过程中发挥作用(Agrawaletal.,2002)。黄瓜(CucumissativusL.)隶属于葫芦科甜瓜属，是世界上最重要的蔬菜作物之一，我国很早就开始选择和培育黄瓜品种并在各地广泛种植(张文烁等,2020)。黄瓜生长过程中会受到不同病原菌的侵染，严重影响了黄瓜的品质及产量。在上世纪70年代，我国黄瓜种植业大面积爆发细菌性角斑病，到目前为止仍是影响黄瓜优质高产的最重要的病害之一(孙福在和何礼远,1988)。

　　然而至今我们仍不了解黄瓜及其病原菌——细菌性角斑病它们之间互作的分子机制。本研究根据前期构建的黄瓜叶cDNA文库数据进行筛选比对，获得了编码CsATX1基因的全长序列，通过生物信息学分析预测该基因的功能。此外，进一步采用荧光定量PCR技术检测了CsATX1基因在黄瓜细菌性角斑病菌诱导下的表达水平，为探求黄瓜铜伴侣蛋白基因的功能奠定基础。

　　1结果与分析

　　1.1黄瓜叶片总RNA检测采用试剂盒提取总RNA后，用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示rRNA条带清晰，无弥散条带，表明黄瓜叶片总RNA提取的完整性较好;进一步通过核酸蛋白仪分析总RNA的纯度，结果显示OD260/OD280为1.88，在1.8~2.1范围内，说明所提取的黄瓜叶片总RNA纯度较高，可进行后续的反转录实验。

　　1.2黄瓜CsATX1基因cDNA全长的获得以上述提取的黄瓜叶片总RNA反转录的cDNA为模板，用设计的特异性引物(AF1、AR1)进行PCR扩增。结果表明，在Marker的750bp附近出现1个CsATX1基因的特异条带，与预测片段大小吻合。PCR扩增产物经胶回收试剂盒回收纯化，送公司测序后获得一段768bp长度的电子序列。

　　1.3CsATX1全长序列生物信息学分析通过NCBI网站上的ORFFinder对黄瓜CsATX1基因全长(768bp)的开放阅读框即编码区进行查找，结果表明CsATX1基因包含一个288bp的开放阅读框(启动子为ATG，终止子为TAA)，编码95个氨基酸，此外，在编码区的上游和下游分别含有一段145bp的5′非翻译区和一段335bp的3′非翻译区，HMA重金属结合相关区域位于氨基酸序列的11-63位。

　　1.5CsATX1基因响应细菌性角斑病菌诱导的表达情况分析采用细菌性角斑病菌处理黄瓜叶片0~96h，通过荧光定量PCR技术分析不同时间处理下的CsATX1基因表达情况。结果表明，在0~96h内，CsATX1基因的表达水平呈先升高，再降低，然后再升高的变化趋势。从总体上看，经细菌性角斑病菌处理后，CsATX1基因的表达量显著高于对照组(未处理)，最高表达量出现在诱导96h，为对照的190.5倍。以上结果可以看出，黄瓜铜伴侣蛋白CsATX1基因受细菌性角斑病菌的显著诱导，由此可推测CsATX1基因可能具有抵御外来生物胁迫的功能，尤其在防御黄瓜细菌性病害中发挥作用。

　　2讨论

　　近年来，虽然有关植物铜伴侣蛋白的研究已取得了一定进展，但仍然远滞后于对酵母铜伴侣蛋白的研究。就植物比较而言，其中模式植物拟南芥铜伴侣蛋白的研究处于领先地位(杜亚琳,2016)，主要存在两种类型的ATX1-like铜伴侣蛋白基因，ATX1-type和CCH-type;其中ATX1-type蛋白在无铜锌超氧化物歧化酶SOD参与时，可以通过其自身具有的抗氧化能力对细胞起保护作用(Puigetal.,2007)，即ATX1是一个独立于SOD途径的氧自由基消除剂(Itohetal.,2009)。近年来，黄瓜中虽然有关铜吸收、转运基因(CCH)被发现(井鑫,2006)，但我们对该类蛋白了解得十分有限，尤其在抗病防御方面的生理功能仍不清楚。本研究中，我们克隆了黄瓜铜伴侣蛋白ATX1基因的cDNA全长序列，并利用生物信息学方法对CsATX1进行序列分析和结构预测。

　　研究发现CsATX1无跨膜结构和信号肽，这与拟南芥AtATX1蛋白预测的结果一致，推测CsATX1并非膜结合蛋白，且没有翻译后的转运过程，预测其在细胞质中行使功能。CsATX1的氨基酸序列进行潜在磷酸化位点分析，预测结果显示该蛋白有10个磷酸化位点，通常来说，蛋白质中磷酸化位点的数目与其发挥的生物学功能呈正比，即位点越多，该蛋白发挥的生物学功能越多。此外，系统进化树发现CsATX1的结构非常保守，与拟南芥AtATX1的相似度达70%左右，推测黄瓜CsATX1铜伴侣蛋白的功能可能与拟南芥铜伴侣蛋白AtATX1功能类似，侧重于参与细胞内铜运输和活性氧的清除。在黄瓜侵染性病害中，细菌性角斑病是其中最为重要的病害之一。近年来，该病害几乎为害全国各大黄瓜种植区，严重时发病率可高达100%，致使整个温室大棚的黄瓜全部染病而死，给瓜农们造成了巨大经济损失(彭月等,2021)。

　　目前该细菌性病害的防治仍以化学防治为主，众所周知，化学防治不仅会带来农药残留，污染环境，而且长期使用还会导致病害产生抗药性，提高对其防治的难度系数。因此十分有必要进一步深入研究寄主植物与病原物之间互作的分子机制，为今后有效防治黄瓜细菌性角斑病奠定基础。

　　3材料与方法

　　3.1试验材料本研究所用到的黄瓜品种(D0462)和细菌性角斑病菌均由东北农业大学园艺学院惠赠。(1)开展时间：在黄瓜处于3片真叶期时进行;(2)处理方法：制备1×108cfu/mL菌悬液，用喷雾器向黄瓜叶面均匀喷洒，喷至叶面布满水珠但不滴下即可，对照组喷洒等量的无菌水;(3)诱导时间：分别诱导0、8、24、48、72、96h;(4)诱导后收集叶片，用无菌水冲洗叶面3~4遍，并用滤纸吸干水分，液氮中速冻后，置于-80℃保存备用。

　　3.2黄瓜叶片总RNA的提取将黄瓜叶片在液氮中快速研磨至粉末状，采用植物RNA试剂盒提取总RNA，具体方法按照说明书进行。提取黄瓜叶片总RNA后，分别采用琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪对其质量进行检测。

　　3.3CsATX1全长基因克隆根据课题组前期获得的黄瓜cDNA文库数据进行比对分析(刘关君等,2009)，获得了一个铜伴侣蛋白CsATX1基因全长序列，根据该序列设计特异性引物AF1、AR1，以提取的黄瓜总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增该序列，具体反应体系如下(50μL)：cDNA模板2.5μL，引物AF1、AR1(浓度为10μmol/L)各2μL，2×PCRMix25μL，其余用ddH2O补足。PCR扩增条件如下：首先，95℃预变性5min;95℃变性30s、58℃退火40s、72℃延伸40s，40个循环;最后再72℃延伸7min。PCR产物经胶回收纯化后送哈尔滨生物公司测序。

　　3.4序列分析CsATX1基因所包含的编码区序列采用NCBI中的ORF(Openreadingframe)程序查找。氨基酸的理化性质采用ProtParamtool软件进行分析。CsATX1蛋白跨膜区预测采用TMHMM在线软件;CsATX1蛋白的信号肽预测采用Signalp5.0软件。CsATX1蛋白的保守结构域通过NCBI中CDD程序进行分析。CsATX1蛋白的潜在磷酸化位点用Netphos3.1server进行分析。CsATX1亚细胞定位分析分别采用Plant-mPloc和psortprediction在线程序进行。CsATX1氨基酸序列的二级、三级结构分析，分别利用SOPMA和SWISS-model进行预测。最后，下载与CsATX1比对相似性较高的氨基酸序列，采用软件ClustalX和MEGA10.1构建系统进化树。

　　3.5qRTPCR分析CsATX1基因的表达情况采用细菌性角斑病菌对黄瓜叶片进行不同时间的诱导处理，侵染时间分别为0、8、24、48、72和96h，侵染后分别提取不同时间处理的黄瓜叶总RNA，并逆转录成cDNA后，采用荧光定量PCR方法，对细菌性角斑病菌处理下的黄瓜CsATX1基因表达情况进行检测。在PCR管中加入cDNA为模板1μL，10μmol/L引物(AF-q,AR-q)及内参引物(18S-F1,18S-R1)(表1)各0.8μL，2×SYBRPremixExTaq混合液10μL，体系为20μL，不足用ddH2O补足。采用核酸扩增荧光检测仪(AgilentMx3000P)进行qRT-PCR反应，反应条件为：95℃预变性30s;95℃15s，58℃30s，72℃30s，40个循环，反应结束后根据2-ΔΔCt计算相对表达量(LivakandSchmittgen,2001)。

　　参考文献

　　AgrawalG.K.,RakwalR.,JwaN.S.,andAgrawalV.P.,2002,CharacterizationofanovelricegeneOsATXandmodulationofitsexpressionbycomponentsofthestresssignallingpathways,PhysiolgiaPlantarum,116(1):87-95.

　　DuY.L.,2016,IdentificationandanalysisofCopperdeficiencysensitivemutantinArabidopsis,GuizhouNongyeKexue(GuizhouAgriculturalScience),44(8):80-83.

　　(杜亚琳,2016,拟南芥缺铜敏感突变体的鉴定分析,贵州农业科学,44(8):80-83.)ItohS.,OzumiK.,KimH.W.,NakagawaO.,McKinneyR.D.,FolzR.J.,ZelkoI.N.,Ushio-FukaiM.,andFukaiT.,2009,NovelmechanismforregulationofextracellularSODtranscriptionandactivitybycopper:roleofantioxidant-1,FreeRadicalBiologyandMedicine,46(1):95-104.

　　作者：孙婷婷1孟令波2李淑敏