医师在线杂志浅谈常见皮肤癣菌基因分型

　　医师在线杂志浅谈常见皮肤癣菌基因分型 推荐本站特色杂志：《医师在线》是由国家食品药品监督管理局南方医药经济研究所主管主办的国内外公开发行的国家级学术性期刊。国内刊号CN：44-1700/R;国际刊号ISSN：1671-8725。是一份由中国医师协会和SFDA南方医药经济研究所联手打造的面向医疗机构的临床医师、医疗机构的管理人员、卫生行政管理机构管理人员、和药学研究人员的医学专业周报。

　　【摘要】 目的 建立快速、简便鉴别4种常见皮肤癣菌(红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和石膏样小孢子菌)的分子生物学基因分型方法。方法 将我室分离培养得到的18株红色毛癣菌、12株须癣毛癣菌、8株絮状表皮癣菌和6株石膏样小孢子菌接种于PDA培养基上培养2周后,分别收集菌丝体并用氯化苄法提取DNA,运用随机扩增多态性DNA分析的方法，以单个引物(GACA)4进行随机扩增。检测聚合酶链反应产物，并根据电泳后指纹图谱的差异进行种属间鉴别。结果 同种不同株的皮肤癣菌电泳后指纹图谱相同,不同种皮肤癣菌电泳后指纹图谱有显著差异。结论 运用随机扩增多态性DNA分析的方法，可对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和石膏样小孢子菌的基因型进行快速鉴别,能够协助临床早期诊断。

　　【关键词】 医师在线杂志,表皮癣菌属,基因型,随机扩增多态DNA技术

　　皮肤癣菌是浅部真菌病的主要致病菌种，是一群浅在寄生性真菌，主要侵犯皮肤、毛发和指(趾)甲，寄生或腐生于表皮角质、毛发和甲板的角蛋白组织中。浅部真菌病简称癣，包括体癣、手足癣、头癣、甲癣等，是皮肤科常见病，其发病率、复发率均较高，所以对其主要致病菌种——皮肤癣菌的鉴定是非常必要的。传统的皮肤癣菌鉴定方法主要依据菌落形态、镜下结构特征，必要时辅以必需的鉴别试验。但皮肤癣菌菌落形态多样，容易变异，给鉴定带来了很多困难[1]。近年来，逐渐开展了多种真菌的分子生物学鉴定方法，PCR技术因具有特异性强、敏感性高的特点，很早就被用于深部真菌病的诊断。本文采用随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹图谱分析的方法,从基因型的角度对常见的皮肤癣菌的DNA进行鉴别，以快速稳定区分4种常见皮肤癣菌的基因型。现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及其来源

　　1.1.1 菌株 红色毛癣菌18株，须癣毛癣菌12株，絮状表皮癣菌8株，石膏样小孢子菌6株，从青岛大学医学院附属医院、青岛市人民医院等5家医院甲癣病人病甲标本中分离培养取得。

　　1.1.2 试剂 DNA抽提缓冲液按文献[2]方法配制，氯化苄为上海山蒲化工公司产品，TaqDNA聚合酶PCR反应缓冲液以及dNTPS为大连宝生物公司产品。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 真菌DNA制备 实验菌株于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上28 ℃培养2周，用无菌生理盐水洗涤下菌丝体,研磨后离心得孢子沉淀，用氯化苄法[2]提取基因组DNA。

　　1.2.2 聚合酶链反应(PCR)扩增 以寡核苷酸重复序列(GACA)4为单个引物，反应体系25 μL,其中包括:50 ng模板DNA，2 μL 10×PCR反应缓冲液(不含Mg2+)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L),2 U的TaqDNA聚合酶,2 μL合成引物(10 μmol/L),2 μL MgCl2(25 mmol/L)。反应条件:起始变性94 ℃ 5 min;变性94 ℃ 1 min，退火47 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min,37个循环;延伸72 ℃ 6 min。产物于20 g/L琼脂糖凝胶电泳(4.5 V/cm) 1.5 h,紫外线灯下照相观察。

　　2 结 果

　　从电泳凝胶上可观察到，4种菌株均得到有效扩增,不同种皮肤癣菌产生具有不同特征的电泳带型。其中红色毛癣菌的主要扩增条带有4条，大小分别约590、530、480、350 bp，特征主条带为590、350 bp;须癣毛癣菌主要扩增条带有7条,大小约690、590、540、500、450、390、350 bp,特征主条带为690、590、500 bp共3条;絮状表皮癣菌主要扩增条带有4条,大小约590、390、350、210 bp,特征主条带为350、210 bp;石膏样小孢子菌主要扩增条带有5条，大小约590、490、350、310、250 bp,特征主条带为490、310、250 bp共3条。相同菌种的DNA主要带型一致：18株红色毛癣菌带型一致，未见种内差异;12株须癣毛癣菌带型一致，未见种内差异;8株絮状表皮癣菌带型一致，未见种内差异;6株石膏样小孢子菌带型一致，未见种内差异(图1)。

　　3 讨 论

　　RAPD分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物，通过PCR反应扩增靶细胞DNA,扩增产物经凝胶电泳,分析DNA片段大小和数量多态性,从而比较靶基因差异的技术。该方法操作简便、迅速,便于大规模使用,已陆续用于酵母菌和丝状真菌的鉴定、分类和流行病学研究。MEYER等[3]用寡核苷酸重复序刊(GACA)4、(GTG)及M13中心序列(5′?GAGGGTGGCGGTTCT?3′)等3种引物作为RAPD的随机单引物,对42株新生隐球菌进行研究,结果表明RAPD具有高度重复性,且在种、变种和单个菌株水平上存在差异。LOUDON等[4]报道，RAPD对曲霉菌鉴定和分型有良好的应用价值。

　　本文应用RAPD方法和引物(GACA)4对4种常见的皮肤癣菌(包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和石膏样小孢子菌共44株)进行了PCR扩增，结果显示，不同种的真菌DNA经扩增后产生不同的DNA带型;同一菌种的同一样品在不同次实验中，相同引物产生的DNA带型一致，并且带型清晰，重复性良好。另外,我们分离的红色毛癣菌表型为羊毛型、绒毛型的有10株，粉末、沟纹型的6株，颗粒型的2株，扩增后其基因型相同。须癣毛癣菌表型为羊毛、绒毛型8株，粉末型4株，扩增后其基因型亦相同。可见本方法具有种属间特异性而无种内特异性。本文结果与FAGGI等[5]的结果不一致,其原因可能是地方菌株差异所致。

　　目前，在临床上对皮肤癣菌传统鉴别主要依据培养菌形态、生理、生化等方法。但在分离培养过程中，皮肤癣菌受培养基类型、pH值、培养温度等因素的影响容易失去典型的表型特性而难以鉴别[6]。例如，红色毛癣菌的菌落产红现象受外界因素的影响在失去产红能力后菌落形态与须癣毛癣菌极为相似,某些表型的红色毛癣菌菌株也会使尿素琼脂培养基变色;而须癣毛癣菌某些菌株产生色素后也酷似红色毛癣菌。这些现象可能造成检验时间延长甚至引起误检。而我们采用的RAPD方法是以皮肤癣菌的基因组DNA为模板PCR扩增后进行指纹图谱分析，有效解决了以上问题。且该方法操作简便、节省时间、重复性良好，是形态学鉴定方法的一个有力补充。随着检验科室设备的不断更新,技术人员水平的不断提高,相信该项技术一定会在临床逐步开展。

　　【参考文献】

　　[1]LIU D, COLOE S, BAIRD R, et al. Application of PCR to the identification of dermatophyte fungi[J]. Med Microbiol, 2000,49(4):493?497.

　　[2]ZHU H, JUN F, ZHU L H. Isolation of genomic DNA from plant fungi and bacteria using benzyl, chloride[J]. Nucl Acid Res, 1993,21:5279?5280.

　　[3]MEYER W, MITCHELL T G. Polymerase chain reaction fingerprinting in fungi using single primers specific to minisatellites and simple repetitive DNA sequences: strain variation in Cryptococcus neoformans[J]. Electrophoresis, 1995, 16 (9): 1648?1656.

　　[4]LOUDON K W, BURNIE J P, COKE A P, et al. Application of polymerase chain reaction to fingerprinting Aspergillus fumigatus by random amplification of polymorphic DNA[J]. J Clin Microbiol, 1993,31(5):1117?1121.

　　[5]FAGGI E, PINI G, CAMPISI E, et al. Application of PCR to distinguish common species of dermatophytes[J]. J Clin Microbiol, 2001,39(9):3382?3385.

　　[6]徐永生，徐健，武静，等. 真菌性鼻窦炎的诊断及鼻内镜手术治疗效果[J]. 齐鲁医学杂志， 2006,21:317?318.