刺五加多糖对糖尿病大鼠代谢功能的影响及作用机制

《刺五加多糖对糖尿病大鼠代谢功能的影响及作用机制》论文发表期刊：《北华大学学报(自然科学版)》；发表周期：2021年03期

《刺五加多糖对糖尿病大鼠代谢功能的影响及作用机制》论文作者信息：张海燕( 1993—) ，女，硕士，医师，主要从事内分泌疾病基础及临床研究; 通信作者: 熊莉华 ( 1973—) ，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事内分泌疾病基础及临床研究．

　　摘要：目的 探讨刺五加多糖对糖尿病大鼠代谢功能的影响及作用机制方法 尾静脉注射链脲佐菌素联合高脂饮食制备2型糖尿病大鼠模型，随机分为模型组、刺五加多糖低剂量组(60 mg/kg)、中剂量组(120 mg/kg)、高剂量组(240mg/kg);另设置普通饲料喂养的大鼠为对照组·连续给药6周后观察大鼠的一般状况，腹主动脉取血，检测空腹血糖、糖化血红蛋白、血脂指标、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛水平，取血后迅速分离肝脏组织，进行HE染色：采用Western blot检测葡萄糖转运蛋白4Glucose transporter 4，GLUT-4)、胰岛素受体底物2(Insulin receptor substrate 2.1RS-2)、过氧化物酶体增殖物激活受体y(Peroxisome proliferator-activated receptor-y，PPAR-y)、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3kinase，P13K)、磷酸化Akt蛋白表达水平结果 与模型组大鼠比较，刺五加多糖中、高剂量组大鼠体质量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05);刺五加多糖各剂量组大鼠12h饮水量、尿量、进食量均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05).与模型组大鼠比较，刺五加多糖中、高剂量组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平明显降低，高密度脂蛋白水平明显升高;刺五加多糖低、中、高剂量组大鼠SOD、过氧化氢酶、谷胱甘脚过氧化物酶水平明显升高，丙二醛水平明显降低上述差异均具有统计学意义(P<0.05)，与模型组大鼠比较，刺五加多糖中、高剂量组GLUT-4.IRS-2.PPAR-y、PI3K、磷酸化Akt蛋白表达水平明显升高，刺五加多糖低剂量组GLUT-4、PPAR-y蛋白表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.0).结论 刺五加多糖在改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢中疗效确切，激活IRS-2/P13K/磷酸化Akt信号通路和上调GLUT-4和PPAR-y表达是其作用机制之一.

　　关键词：糖尿病大鼠;刺五加多糖：代谢功能;肝脏;作用机制

　　Abstract: Obiective To investigate the effect of Acanthopanax senticosus polysaccharides on metabolic function and its mechanism in diabetic rats. Method The rat model of tvpe 2 diabetes mellitus was established by tail injection of streptozotocin combined with high-fat diet. The rats were randomly divided into model group. low-lose Acanthopanax senticosus polysaccharide group (60 mg/kg) , medium-dose Acanthopanax senticosus polysaccharide group (120 mg/kg) and high-dose Acanthopanax senticosus polysaccharide group (240 mg/kg) . The rats fed with nommal diet were set as control group. After 6 weeks of continuous administration, the general condition of rats wasobserved. Blood samples were taken from abdominal aorta to detect the levels of fasting blood glucose , glycosylated hemoglobin, fasting insulin , blood lipid index , superoxide dismutase (SOD) , catalase , glutathione peroxidase and malondialdehyde. Westem blot was used to detect the expression of glucose transporter 4 (GLUT-4) , insulin receptor substrate 2 (IRS-2) . peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR-y) , phosph-atidylinositol 3-kinase (PI3K) and phosphorylated Akt protein. Results Compared with the model group. the body weight of rats in medium and high dose groups of Acanthopanax senticosus polysaccharide increased significantly (P<0.05): The amount of drinking water, urine and food intake of rats in low, medium and high dose groups of Acanthopanax senticosus polysaccharide decreased significantly (P<0.05) . Compared with the model group, the levels of fasting blood glucose, glycosylated hemoglobin, triglyceride, total cholesterol and lowdensity lipoprotein significantly decreased, while the levels of high-dlensity lipoprotein significantly increased in the medium and highdose Acanthopanax senticosus polysacchar groups (P<0.05) . The levels of SOD, catalase and glutathione peroxidase in low, medium and high dose Acanthopanax senticosus polysacchar groups significantly increased, while the level of malondialdehvde significantly decreased (P<0.05) . Compared with the model group, the protein expression levels of GLUT-4. IRS-2. PPAR-y, PI3K and phosphorylated Akt in the medium and high dose groups of Acanthopanax senticosus polysacchar significantly increased, and the protein expression levels of GLUT4 and PPAR-y in the low dose group of Acanthopanax senticosus polysacchar significantly increased (P <0. 05 ).Conclusion Acanthopanax senticosus polysacchar has a definite effect on improving glucose and lipid metabolism in type 2 diabetic rats. One of its mechanisms is to activate IRS-2/PI3K/phosphorylated Akt signaling pathway and uptregulate the expression of GLUT-4 and PPAR-y.

　　Key words: diabetic rats: Acanthopanax senticosus polysacchar: metabolic function: liver: mechanism of action

　　2型糖尿病的发生与发展是多种因素共同作用的结果，随着病程的进展，会出现视网膜病变、肾损伤等一系列并发症[1.2型糖尿病临床主要通过注射胰岛素和口服降糖药来控制血糖，为进一步提升血糖控制效果，近年来中药制剂受到了广泛关注2刺五加主要分布于我国吉林、黑龙江、辽宁、河北等省区，具有“补中益精”的作用[3]对于刺五加全药降糖作用已有研究报道，但仍未明确其中具体起效的成分，这不利于刺五加相关降糖药物的开发与应用[1.目前，从天然药物中发现的降糖成分包括生物碱、多糖、皂苷、黄酮等[].本研究通过动物学实验来探讨刺五加多糖对糖尿病大鼠代谢功能的影响及作用机制，旨在为降糖中药制剂的研发提供参考.

　　1材料与方法

　　1.1 动物与主要试剂

　　清洁级雄性Wistar大鼠(中国科学院上海实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(沪)20140004)100只，6周龄，体质量130-170 g.刺五加多糖(宁波金艾农生物科技有限公司，总收率为原刺五加质量的0.61%，HPLC纯度>90%);链脉佐菌素(上海抚生生物有限公司);血m糖、糖化血红蛋白、血脂指标检测试剂盒(北京九强生物股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(武汉明德生物股份有限公司);葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter 4，GLUT4)、胰岛素受体底物2(Insulin receptor substrate 2，1RS-2)、过氧化物酶体增殖物激活受体y(Peroxisome proliferatoractivated receptor-y，PPAR-y)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosph-atidylinositol 3kinase，PI3K)、磷酸化Akt一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗(北京博奥森生物有限公司).

　　1.2方法

　　1.2.1 2型糖尿病大鼠模型制备

　　100只Wistar大鼠适应性喂养7d，室温24℃，湿度60%，灯光模拟昼夜交替，自由饮水和进食随机分为对照组15只，实验组85只对照组仅给予普通饲料;实验组给予高脂饲料，具体配方：1.5%胆固醇，0.25%胆酸钠，10%猪油，5%蔗糖，83.25%基础饲料喂养4周后禁食12 h，按30 mg/kg剂量尾静脉注射链脲佐菌素制备2型糖尿病模型，注射链脲佐菌素72h后尾静脉取血，检测血糖水平，选择其中60只血糖超过11.1 mnol/L的大鼠进行后续实验.

　　1.2.2 分组与给药

　　将60只造模成功的大鼠随机分为模型组、刺五加多糖低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组15只对照组和模型组大鼠按10 ml./kg每日给予蒸馏水灌胃;刺五加多糖低剂量组、中剂量组、高剂量组根据刺五加人体临床用药上限的2倍、4倍、8倍剂量折算，即刺五加多糖给药剂量分别为60，120.240 mg/kg，制成10 ml./kg药液灌胃，连续给药6周.

　　1.2.3 一般状况观察及生化指标检测给药6周结束后测定大鼠的体质量，使用代谢笼测定大鼠12h的饮水量、尿量、进食量禁食8h，腹主动脉取血，3000 r/min离心10 min，收集血清，

　　-20℃保存待测·检测大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、血脂指标、SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛水平.

　　1.2.4 肝脏组织病理学检测

　　取血后迅速分离大鼠肝脏组织，放于冰上切取部分组织-80℃保存，用于Western blot检测.其余肝组织石蜡包埋、切片后行HE染色，光学倒置显微镜下拍照，分析组织病理学改变.

　　1.2.5 胰岛素信号通路相关蛋白表达情况Wetern blot检测大鼠肝组织中GLVT-4、IRS-2 PPAR-y、PI3K、磷酸化Akt蛋白表达水平.取标本组织放于培养皿中，剪成组织碎块放入离心管中，加入磷酸缓冲液进行组织匀浆，冰上静置20 min，4℃ 12000/min离心10 min，收集上清液放入新离心管中，BCA试剂盒测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，湿法转至PVDF膜上，按说明书比例将稀释后的一抗加至PVDF膜，将膜完全覆盖，摇床上4℃过夜，次日加稀释后的二抗，2h后显影，ImageJ读取条带上的灰度值.

　　1.3 统计学分析

　　应用SPSS 21.0对数据进行处理与统计学分析，实验数据以均数土标准差(s)表示，进行方差分析和1检验，以P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2果

　　2.1 各组大鼠体质量、饮水量、尿量及进食量模型组大鼠体质量明显高于对照组大鼠，12 h饮水量、尿量、进食量明显高于对照组大鼠，差异均具有统计学意义(P<0.01).与模型组大鼠比较，刺五加多糖中、高剂量组大鼠体质量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05);刺五加多糖各剂量组大鼠12h饮水量、尿量、进食量均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05).见表1.

　　2.2 各组大鼠糖脂代谢指标模型组大鼠各糖脂代谢指标与对照组之间比较差异均具有统计学意义(P<0.01);与模型组大鼠比较，刺五加多糖中、高剂量组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平明显降低，高密度脂蛋白水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05).见表2.

　　2.3各组大鼠氧化应激指标

　　模型组大鼠SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平均明显低于对照组，丙二醛水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组大鼠比较，刺五加多糖低、中、高剂量组大鼠SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平明显升高，丙二醛水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05).见表3.

　　2.4 刺五加多糖对大鼠肝脏病理学改变的影响

　　对照组大鼠肝组织结构清晰，细胞排列整齐且 形态完整.模型组大鼠肝组织出现明显的病理学改 变，表现为肝细胞大泡性的脂肪样变、肝索排列紊 乱、肝静脉扩张、细胞肿胀.刺五加多糖低剂量组大 鼠肝组织肝索排列欠整齐，部分肝细胞肿胀; 中剂 量组大鼠肝组织肝索排列较整齐，少量肝细胞肿胀 和淡染; 高剂量组大鼠肝组织肝索排列较整齐，很 少见肿胀肝细胞.见图 1.

　　2.5 刺五加多糖对大鼠胰岛素信号通路相关蛋白 表达的影响

　　模型组胰岛素信号通路相关蛋白 GLUT-4、 IRS-2、PPAR-γ、PI3K、磷酸化 Akt 的表达水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义( P<0.05) ; 与模型组大鼠比较，刺五加多糖中、高剂量组 GLUT- 4、IRS-2、PPAR-γ、PI3K、磷酸化 Akt 蛋白表达水平明显升高，刺五加多糖低剂量组 GLUT-4、PPAR-γ蛋白表达水平明显升高，差异具有统计学意义( P< 0.05) .见图 2、表 4.

　　3 讨 论

　　本研究通过脲佐菌素联合高脂饮食诱导糖尿病大鼠模型，结果显示: 模型组大鼠体质量明显低 于对照组大鼠，且出现多饮水、多进食、多尿量的典 型 2 型糖尿病症状，提示造模成功.刺五加多糖能够明显改善大鼠多饮水、多进食、多尿量的症状，提 示刺五加多糖具有抗 2 型糖尿病的药理活性.2 型糖尿病患者多伴有不同程度的糖脂代谢紊乱，高脂血症又会进一步加重胰岛素抵抗[6].本研究结果显示: 刺五加多糖中、高剂量能够有效降低 2 型糖尿病大鼠的血糖和血脂水平，进一步证明了刺五加多糖对 2 型糖尿病大鼠糖脂代谢的回调作用.

　　氧化应激是活性氧等物质因清除率下降所致 的体内抗氧化防御与自由基生成之间平衡失调，在糖尿病及其并发症发生、发展过程中发挥重要作 用[7].SOD 是清除氧自由基的主要活性酶之一[8]; 过氧化氢酶能够较好地清除细胞产生的过氧化氢， 在维持细胞氧化平衡中发挥重要作用[9]; 谷胱甘 肽过氧化物酶是在人体中广泛存在的催化氧化酶，能够清除氧自由基[10 血清SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平变化能够较好地反映出体内脂质过氧化程度.本研究结果显示：刺五加多糖低、中、高剂量组大鼠SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平明显高于模型组，丙二醛水平明显低于模型组，提示刺五加多糖能够有效降低2型糖尿病大鼠的氧化应激水平，提高抗氧化能力.肝脏在维持血糖稳定方面发挥关键作用，是机体糖代谢的重要器官[1].本研究结果显示：刺五加多糖能够有效改善2型糖尿病大鼠肝脏病理学改变，减轻肝细胞肿胀及中心粒细胞浸润程度，有利于糖脂代谢指标的改善.肝脏糖代谢异常能够引发胰岛素抵抗，胰岛素在肝脏中主要通过1RS-21

　　P13K/磷酸化Akt信号通路发挥作用[12.同时，GLUT4功能异常是脂肪组织发生胰岛素抵抗的主要原因[1;PPAR-y是配体活化的核转录因子，参与胰岛素抵抗的发生与发展[1];脂肪组织是PPAR-y激活剂的主要靶点[5]本研究结果显示：刺五加多糖中、高剂量能够激活IRS-2/P13K/磷酸化Akt信号通路，同时上调GLUT4和PPAR-y表达;而刺五加多糖低剂量仅能够上调GLUT4和PPAR-表达，无法有效激活IRS-2/P13K/磷酸化Akt信号通路.

　　综上所述，本研究证实了刺五加多糖中、高剂量在改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢中的疗效，同时能够明显降低氧化应激水平，保护肝组织正常结构和功能激活1RS2/P13K/磷酸化Akt信号通路和上调GLUT-4和PPAR-表达是其作用机制之一.

　　参考文献：

　　[1]贺小宁，张雅雯，阮贞，等中国2型糖尿病患者慢性并发症患病率与次均医疗费用研究[J].中华内分泌代谢杂志，2019，35(3)：200-205.

　　[2]孙丰卉，王秋虹，邱宗林，等中医药治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的机制研究进展[J].医学综述，2018，24

　　(20)：4068-4072，4077.

　　[3]徐燃，吴杰，董林林，等·刺五加全球产地生态适宜性及品质生态学研究[].药学报，2018，53(2)：313-320.

　　[4]董文婷，霍金海，张海燕，等刺五加叶的药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2015，21(23)：220-223.

　　[5]常燕飞，李爱珍天然活性成分对糖尿病的调控作用及其相关基因的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2016，7(10)：3900-3905.

　　[6]SATHIALINGAM M，SAIDIAN M，ZHANG S，et al.Evaluation of cyeloferin supplement on health parametersin experimentally induced diabetic rats with and without exogenous insulin[J].Journal of Dietary Supplements，2019，16(4)：454462.

　　[7]YAZIR Y，POLAT S.UTKAN T，et al.Role of the nitric oxide-soluble guanylyl eyclase pathway in cognitive deficits in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Psychiatry and Clinical Psychopharmacology，2019，29(1)：3444.

　　[8]LI J.WANG P P.CHEN Z.et al.Fenofibrate amelioratesoxidative stressinduced retinal microvascular dysfunction in diabetic rals[J].Current Eve Research，2018，43(11)：1395-1403.

　　[9]张娴，刘莉白藜芦醇粉对2型糖尿病患者血糖及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶及丙二醛的影响[J].河北中医，2017，39(1)：19-22，75.

　　[10]ABA PE.ASUZU I U.Clyeosylated haenoglobin values of alloxaninduced diabetic rats treated with graded doses of Cussonia arborea extract[J].Joumal of Applied Animal Research.2018，46(1)：14784482.

　　[11]TIWARI B K.ABIDI A B.RIZVI S I，et al.Effect of oral supplementation of composite leaf extract of medicinal plants on biomarkers of oxidative stress in induced dia-betic Wistar rats[J].Archives of Physiology and Biochemistry，2018，124(4)：361-366.

　　[12]周琦，朱向东，全小林，等葛根芩连汤对2型糖尿病模型大鼠胰岛细胞IRS-2/P13K-Akt通路的影响[J].中医杂志，2018，59(11)：973-977.

　　[13]左莹，刘菊华，严宗逊，等，胃肠转流术改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗和增加外周脂肪和肌肉组织中GLUT4基因表[J.医，2019，48(22)：3790-3793.

　　[14]徐建方，路瑛丽，冯连世.低氧训练对肥胖大鼠脂肪组织miRNA-27b/PPARy脂代谢通路的影响[J].中国体育科技，2018，54(5)：56-64.

　　[15]TIRUMANI P，VENU S，SRIDHAR G，et al.Delaying of cataract through intervention of Hemidesmus indicus in STZ induced diabetic rats[J].Natural Product Research，2018，32(11)：12951298.