中国传统发酵食品微生物多样性研究进展

　　摘要：中国传统发酵食品由于微生物的发酵作用改善产品的营养价值并赋予产品独特的风味，成为人们饮食中重要的组成部分。文章主要阐述了我国传统发酵食品常用的微生物检测技术，并对中国传统发酵食品微生物多样性的研究进展进行了综述，旨在为筛选优良发酵菌株，调控中国传统发酵食品的发酵过程提供理论参考。

　　关键词：传统发酵食品;测序方法;微生物多样性;核心微生物

　　发酵是一种用于改善食品品质和长期保存食品的加工手段[1]。传统发酵食品通常凭借自然野生菌落发酵为主要生产方式。在进行发酵时通常会引入来自于原料和环境的多种微生物，而这些微生物可利用原料中的营养成分通过三大代谢途径———糖、脂肪和蛋白质代谢改变食物本身的质地及食用品质，产生独特的发酵香气[2]。在我国几千年的历史进程中，开发了原料多样、工艺复杂、种类繁多的传统发酵食品如发酵酒、酸菜、大酱、腊肉等，构成了我国饮食文化重要的组成部分。由于在自然发酵的过程中微生物种类和丰度存在差异，而且常伴有有害菌或致病菌的引入，这会严重影响传统发酵食品的感官品质、风味和食用安全性[3]。

　　因此，揭示传统发酵食品的微生物多样性，探究菌群结构和发酵过程中的核心微生物对科学安全地制作、调控发酵食品有着重要的指导作用，为传统食品的发酵过程工业化、规模化、稳定安全化提供了理论基础。本文重点综述了现代高通量检测方法，对中国传统发酵食品中微生物特殊的多样性结构和主要核心作用微生物、中国传统发酵食品的前景导向进行了展望，为传统发酵食品的加工工艺改良和品质调控提供了理论基础。

　　1中国传统发酵食品微生物多样性研究方法

　　由于传统发酵食品生产方式所涉及到的微生物来源广、种类多、演替演化规律复杂，仅单纯依靠传统人工分离方法不能满足当下人们对传统发酵食品中复杂微生物系统的了解。近些年，随着分子生物技术的不断发展，新一代测序技术正逐渐取代传统培养方法，广泛应用于微生物多样性的分析。这些新一代测序技术一类是扩增子测序，例如一代测序：变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE);二代高通量测序：16SrDNA、ITS测序等;三代测序：16SrDNA全长、宏基因组技术，其优势在于可以对每一条独立的DNA分子进行测序，从而分析得到微生物的物种注释及代谢通路信息。这些技术在发酵酒肉制品、谷物食品等鉴定中都有广泛的应用[4]。

　　1.1PCR-DGGE技术

　　传统的平板分离培养方法过度依赖人工的操作及菌体的生长，实验周期长，不确定性大。PCR-DGGE技术避开了传统检测方法的弊端，采用特异性PCR扩增从样本中提取出来的基因组DNA，在DGGE技术有效分离和快速鉴定后将扩增产物进行分析从而获取到样品中菌群图谱[5]。燕平梅等利用PCR-DGGE技术在不同品种酸菜样品中检测到8种微生物，而散装酸菜的微生物多样性更为丰富，同时，在经16SrDNA测定后，发现乳酸菌属为酸菜中的核心微生物[6]。

　　与传统的测序方法对比，PCR-DGGE技术在对传统方法未能培养出来的菌株进行鉴定时，用时更短，准确度更高，并可对大量样本同时进行测序工作，是研究发酵食品微生物群落结构最常用的分子生物技术之一[7]。但该技术具有一定的局限性，当对复杂的生态系统进行研究时，对丰度较低(低于1%)的微生物无法检测出来[8]。

　　1.2高通量测序技术

　　高通量测序技术是基于高通量测序平台检测特定环境下的微生物，并结合生物与信息学来分析样本中各种微生物物种种类、物种丰度、种群结构、系统演变等相关信息。根据细菌和真菌间的序列差异，高通量测序可以化分为16SrDNA、18SrDNA和ITS测序。16SrDNA主要进行原核微生物的物种鉴定，而18SrDNA和ITS测序主要用于真核微生物的鉴定。

　　相比PCR-DGGE技术，高通量测序通过获得大量测序结果数据，能够对丰度低于0.0001%的痕量菌准确检出，从而系统完整地解析样品中微生物菌相组成。李欣蔚等通过16SrDNA测序技术对自然发酵酸菜样品中的多样性组成进行了分析，与PCR-DGGE技术测定结果相吻合，证实了高通量测序的准确性[10]。在真菌鉴定方面主要有ITS测序技术和18SrDNA技术两种，18SrDNA虽然能有效地鉴定出真核微生物的存在并进行物种注释，但其准确度往往较低，在实际测序中常有部分真菌不能被分类。

　　ITS测序技术较18SrDNA技术测序的准确度更高，对真菌微生物的鉴定能力更强。然而，高通量测序技术由于针对局部DNA区域的鉴定，因此，只能完成微生物属水平鉴定。随着三代测序的蓬勃发展，全长高通量序列测定可以弥补微生物在种水平鉴定上的空白。

　　曹碧璇等利用16SrDNA基因全长序列分析鉴定出自然发酵酸菜液样品中有7个细菌菌属及9个菌种，实现了微生物多样性在种水平上的解析[11]。高通量测序是对传统测序的革新式改变，也是目前最常见的测序方法，成本低廉，且令对发酵食品全部基因的深入分析成为可能。

　　1.3宏基因组技术

　　高通量测序技术促进了组学技术的发展，相较于高通量测序，宏基因组基于对现代基因组学技术的应用，其优势在于不仅可以准确地对样品进行物种注释，而且可以进行功能注释，挖掘部分微生物的功能基因对其代谢途径进行预测，这为开发利用未知或未被培养的微生物、全面探究微生物基因功能性提供了研究基础[12]。彭明芳等利用基因组技术对广西酸菜进行功能注释，结果共注释到17种在碳水化合物和氨基酸代谢与转运功能上丰富的基因，如纤维素酶、果胶酶、淀粉水解酶和酯酶等，预测了微生物在酸菜发酵过程中可能发挥的作用[13]。

　　Guo等利用宏基因组技术在白酒窖泥中发现了乳酸菌、芽孢杆菌和梭菌等细菌与乳酸、乙酸等有机酸及乙醇、酯类等风味化合物产生有关，而半乳酵母、青霉菌和曲霉菌等真菌微生物在白酒发酵中可以产生葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶，这对糖酵解过程影响显著并可将淀粉等大分子物质降解为小分子糖[14]，但宏基因组测序对数据处理核心技术的要求极高，当样本数量极大时，需要进行多次测序，且宏基因组测序方法的定义和算法还不完善，是目前微生物学家面临的一大难题。

　　目前对于研究发酵食品常用的测序方法如上所述，不同的方法各有特点，比如PCR-DGGE技术的高效快速，高通量测序技术的精准分析，基因组技术的功能基因注释。在实际的应用选择中，要结合样品的状态、测序的目的、预期的深度以及性价比进行合理选择。

　　2传统发酵食品微生物多样性及核心微生物研究进展

　　近些年来，学者们对传统发酵食品的微生物多样性展开了研究，产品主要涉及7大类，分别为发酵谷物类、豆类、乳类、蔬菜类、肉类、酸面团类和其他。每一类都包含许多具有代表性的发酵食品。本部分内容针对上述类别的中国传统发酵食品中微生物多样性研究进行了综述。

　　2.1传统发酵乳制品

　　中国传统发酵乳制品主要分为两类，分别是酸奶和奶酪，在新疆、内蒙古、西藏等地有着深远的制作历史。这些发酵乳制品的品质往往因为地理环境因素以及人为因素而呈现出微生物菌群组成上的差异。中国传统发酵乳制品的微生物组成复杂多样，不同地域的微生物组成各有特点，通过对传统发酵乳制品微生物多样性的解析，不仅可以更好地对其品质进行调控还对乳制品同质化以及有效溯源体制的建立有着重要的指导意义。

　　2.2传统发酵谷物制品

　　2.2.1发酵酒类制品

　　我国的酒文化历史深远，酿酒工艺传承了几千年，其中在酿酒过程中，发酵是一个关键的环节。中国发酵酒要经过独特而复杂的系统发酵，由于原料不同，酒曲不同及发酵工艺不同等，衍生出不同种类的发酵酒，其中最具代表性的是白酒、黄酒及米酒。大量研究发现不同酒曲的微生物菌群结构差异较大，赋予了白酒和黄酒不同种香型，如清爽型、凤香型、浓香型、芝麻香型等。

　　中国的传统发酵酸面团制品主要以馒头为主，传统馒头的制作大多以酵子为发酵剂。研究发现，酵子的来源决定了其微生物组成。杨可等发现关中不同地区的馒头酵子中优势菌属均为乳酸菌属，但不同地区的微生物组成差异较大。传统酵子馒头往往风味之间存在差异，这也与酵子中微生物的组成和代谢有着密切联系[47]。Suo等利用高通量测序方法研究了中国传统发酵剂发酵的馒头的微生物多样性及风味成分，结果显示以乳酸杆菌和片球菌为主的优势菌属在呈味方面发挥着重要的作用[48]。

　　马凯等在对传统酵子细菌多样性的研究中进一步确定了乳酸菌中以魏斯氏菌属与乳酸乳杆菌属为主的优势地位，并明确与商业酵母相比，醇类化合物的含量和种类是区分传统酵子发酵馒头与商业酵母的关键[49]。此外，学者们还对发酵茶如普洱茶、黑茶等[50-51]传统发酵食品中微生物多样性进行了研究，为提高产品加工效益和食用品质提供了理论参考。

　　3展望

　　中国传统发酵食品种类多，微生物多样性丰富，大多数仍停留在作坊式、家庭式的制作模式中，只有极少数发酵制品实现了工业化发展。这就使我国传统发酵食品存在工艺缺乏创新、制作周期冗长、安全稳定性较差等原始问题，难以实现传统发酵食品规模化、产业化发展。未来我们不仅需要全面了解传统发酵食品中的菌群结构、关键微生物信息，还需要深入了解发酵过程中与风味或品质有关的功能性微生物的作用，对其发酵机理进行挖掘，获得发酵性能优良的菌种，建立发酵食品菌种保藏库，以期为人为调控中国传统发酵食品的发酵过程，使中国传统发酵食品规模化、产业化、安全化生产。

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　　[2]陈倩，李永杰，扈莹莹，等.传统发酵食品中微生物多样性与风味形成之间关系及机制的研究进展[J].食品工业科技，2021，42(9)：412-419.

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　　[6]燕平梅，魏爱丽，李润花，等.PCR-DGGE法分析酸菜中乳酸菌的多样性[J].中国酿造，2019，38(4)：32-35.

　　[7]YEUNHong，YANGHeesok，LIJingmei，etal.IdentificationoflacticacidbacteriainsaltedChinesecabbagebySDS-PAGEandPCR-DGGE[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture，2013，94(2)：296-300.

　　[8]LIXing，OUXiuqiong，JINGShaohong，etal.AnalysisonmicrobialflorachangesduringprocessingandstorageofspicedgoosebasedonPCR-DGGEcombinedwithconventionalmicrobialculturemethods[J].E3SWebofConferences，2020，145：1018.

　　作者：陈镜如，边鑫，杨杨，邢童林，王子轩，任丽琨，胡良术，何林阳，张娜