沙芦草种子发芽抑制物的初步探究

　　摘要：沙芦草又称蒙古冰草，具有抗旱、抗寒、抗病、耐盐碱等优良性状，是荒漠草原和典型草原地带沙地主要植被之一。沙芦草种子存在发芽率低、发芽持续时间长等野生特性，这对沙芦草人工种子繁育和生产利用造成一定程度的影响。为探究沙芦草种子休眠机制，试验分别用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等 5 种有机溶剂和纯水对沙芦草种子稃壳进行浸提，利用白菜种子发芽试验测定各提取相的抑制性，通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对 5种有机溶剂浸提液进行分离鉴定，确定浸提物质的种类和性质。结果表明：沙芦草种子稃壳的各相浸提液对白菜种子的发芽率、根长及苗高均有不同程度的抑制作用，其中抑制作用最强的是水相，其次是乙酸乙酯相和甲醇相;通过GC-MS 检测，发现沙芦草种子稃壳中存在烷类、醇类、酯类、酮类、苯类、酰胺、缩醛、酸类和酚类等 9 类 32 种有机化合物，其中醇类、酮类和烷类物质的含量相对较高，且大部分为水溶性物质。因此，沙芦草种子稃壳中存在的醇类、酮类和烷类等可溶性物质是引起沙芦草种子休眠的主要原因之一，该研究可为寻找沙芦草种子休眠破除方法提供理论依据。

　　关键词：沙芦草;休眠;抑制物质;GC-MS

　　沙芦草(Agropyron mongolicum)又称蒙古冰草，属禾本科(Gramineae)小麦族(Triticeae)冰草属(Agropyron)多年生草本植物。沙芦草作为我国二级濒危保护植物和农作物野生近缘种，具有抗旱、抗寒、抗病、耐盐碱等优良性状，因此在饲喂家畜、生态保护和遗传育种方面具有重要价值，同时也具有较好的生产性能，是改善荒漠草原、建植人工草原的优良牧草[1]。

　　但沙芦草种子存在发芽率低、发芽持续时间长等野生特性，尤其新收获的沙芦草种子，发芽率只有 10% 左右[2]，且出苗时间较长，这对沙芦草人工种子繁育和生产利用造成一定程度的影响[3]，因此探究沙芦草种子休眠的原因可为之后打破其休眠并进行品种选育、种质资源保存等育种工作奠定一定的基础。近年来，对于沙芦草的研究主要集中在其抗逆性及相关基因表达[4-6]、遗传多样性分析[7-8]及染色体加倍[9-11]等方面，但关于沙芦草种子休眠与萌发特性的研究鲜有报道。种子休眠是指具有活力的种子处于适宜萌发的条件下而不能正常萌发的一种生理现象，它是植物长期适应环境变化的结果，也是植物在系统发育过程中为了抵抗不良生存环境而形成的一种生物学特性[12]。

　　一般而言，禾本科植物种子休眠与种子自身的生理状态密切相关，主要由于种子中存在着某些抑制种子发芽的物质，如氮、氰化氢、乙烯、芳香油类、生物碱类以及各种有机酸类等对细胞分裂、分化与伸长有重要阻碍作用的物质，从而造成种子发芽的推迟或抑制[13]。Kentzer[14]和 Amen[15]认为抑制物质的存在是植物种子休眠的主要原因之一。许多研究也表明，种子的果皮、种皮、胚乳和胚中存在某种化学成分，这些成分可能阻碍了植物生理的某个代谢环节，影响种子发芽进程从而导致种子休眠[16-17]。

　　植物种子中抑制物的种类和存在部位因植物的种类不同而不同，赵昕等[18]对结缕草(Zoysia japonica)种子进行研究，结果表明含有脱落酸等发芽抑制物质影响种子发芽;张丹等[19]研究发现细叶鸢尾(Iris tenuifolia)种皮的甲醇浸提液具有抑制活性，说明种皮中存在萌发抑制物质;Wu 等[20]采用液相色谱-质谱联用技术鉴定了南京椴(Tilia miqueliana)果皮的化学成分，鉴定出酚类、酯类、有机酸、脂类、醛类以及不饱和脂肪酸等化合物，说明其可能在抑制萌发中发挥作用。本研究以新收获的沙芦草种子为材料，通过测定沙芦草种子发芽抑制部位以及稃壳浸提液的生物活性，并利用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)(QP-2010，日本)进一步测定有机化合物的种类，旨在为探明沙芦草种子休眠机制与寻找种子休眠破除方法提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1. 1 试验材料供试沙芦草种子为 2020 年盐池四墩子试验基地新收获的种子。白菜(Brassica pekinensis)种子购于宁夏平罗县宁源种业有限公司，纯度≥95. 0%，发芽率≥90. 0%。

　　1. 2 试验方法

　　1. 2. 1 沙芦草种子发芽抑制部位试验 试验设 2 组处理，一组处理为人工去掉种子的内外稃，另一组不做处理(CK)，每处理 5 个重复。发芽方法为：选取健康、大小一致的沙芦草种子经 0. 5% 的次氯酸钠消毒 5 min，蒸馏水冲洗干净，晾干种子表面水分后，均匀摆放在铺有 2 层滤纸的直径 90 mm 玻璃培养皿中，每皿 100 粒种子，培养皿中浇入约 6 mL 蒸馏水，使滤纸完全浸湿，放入 25 ℃恒温培养箱中光暗交替(12 h 光照/12 h 黑暗)培养。每天进行补水和发芽率统计。

　　1. 2. 2 沙芦草种子抑制物确定试验

　　1)甲醇相浸提液制备。称取 24 g 的沙芦草稃壳，用球磨仪(GT 200，北京)磨碎后，置于 50 mL 的离心管中，加入 25 mL 的 80% 的甲醇，在超声波(600 w，40 kHz)中浸提 30 min，离心取上清液，连续浸提 3 次，将浸提的上清液合并一起，在 60 ℃恒温水浴锅中将甲醇粗提物挥发至干，然后用 100 mL蒸馏水溶解残渣，得到 0. 24 g·mL-1的甲醇粗提母液，将粗提母液分别稀释为 0. 20、0. 16、0. 12、0. 08、0. 04 g·mL-1的浓度，置于 4 ℃条件下保存备用[16，21]。

　　2)不同浓度甲醇相浸提液生物活性测定。选取大小一致、颗粒饱满的白菜种子，用蒸馏水冲洗后，每 100 粒白菜种子置于内垫双层滤纸的培养皿中，每 5 个培养皿为一组，共设 7 组。前 6 组白菜种子培养皿中分别加入浓度为 0. 24、0. 20、0. 16、0. 12、0. 08、0. 04 g·mL-1的甲醇粗提液 5 mL。第 7 组加入蒸馏水作为空白对照。将所有培养皿放在 25 ℃恒温光照培养箱(12 h 光照/12 h 黑暗)培养。统计白菜种子发芽率，并用游标卡尺测定白菜的根长、苗长。

　　3)不同相浸提液的制备。分别用石油醚、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和 H2O 进行沙芦草稃壳浸提液制备。制备方法同甲醇相，得到 5 种不同相的沙芦草稃壳浸提液，置于 4 ℃条件下保存备用。

　　4)不同相浸提液生物活性测定。根据甲醇相浸提液抑制白菜种子发芽确定的适合浓度，来制备甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和 H2O 相浸提液的浓度进行白菜种子生物活性测定。

　　5)沙芦草种子不同相浸提液化学成分分析。根据沙芦草种子不同相浸提液对白菜发芽抑制试验的结果，选取有明显抑制活性的有机相浸提液，制备成浓缩样品在宁夏大学测试分析中心用岛津气相色谱-质谱联用仪(GCMS-TQ8040)进行化学成分分析。气相色谱条件为：载气为氦气，分流进样，分流比 10∶1，柱流量 1. 0 mL·min-1。程序升温从 60 ℃开始，保持 10 min，以 10 ℃·min-1的速率上升至 210 ℃，保持 10 min。进样口温度 250 ℃，离子源温度 200 ℃，接口温度 250 ℃，进样量 1 μL。进样结束后使用质谱图库检索与 Nist 2008 标准谱图核对比检测样品中成分。检测依据 GB/T6041-2002，最后进行人工分析，以确定各组分物的化学结构和名称。

　　1. 3 数据处理使用 Excel 2013 软件进行基础数据处理，DPS 2005 进行数据分析。

　　2 结果与分析

　　2. 1 沙芦草种子发芽抑制部位

　　对照 CK 组沙芦草种子的发芽势、发芽率分别为 10. 80%、29. 20%，去稃处理组沙芦草种子发芽势、发芽率分别为 49. 60%、63. 20%，去稃壳的沙芦草种子发芽势、发芽率较对照组分别提高了 359. 26% 和116. 44%，去稃处理显著提高了沙芦草种子发芽势及发芽率，说明沙芦草种子发芽主要由稃壳抑制;去稃处理的沙芦草胚根显著长于对照 CK 组，但对沙芦草胚芽的影响并不显著，说明沙芦草的稃壳对胚根的生长也产生一定的影响。

　　2. 2 不同浓度甲醇相浸提液的生物活性测定

　　随着甲醇浸提液浓度的升高，白菜种子发芽率、根长及苗高均呈明显降低趋势，甲醇浸提液对白菜幼苗生长的抑制强度与浓度呈正相关。当浸提液浓度为 0. 08 g·mL-1 时，白菜种子的发芽率为76. 80 %，与对照 CK 相比降低了 18. 80%;当浸提液浓度达到 0. 16 g·mL-1时，其发芽率已降至 32. 80%，与对照组 CK 相 比 降 低 了 62. 80%;且 根 长 为 对 照 组 CK 的7. 69%，苗高为对照组 CK 的 50. 48%，0. 16 g·mL-1的浸提液浓度对白菜种子发芽率和生长有明显的抑制，可作为制备其他有机相的浸提浓度。

　　2. 3 各相浸提液的生物活性测定

　　不同相浸提液均不同程度的抑制了白菜种子萌发，各相浸提液对白菜种子发芽率抑制作用均达到显著水平，其中乙酸乙酯相对白菜种子发芽率抑制作用最大，与对照相比降低了 59. 33%，石油醚相的抑制作用最小，较对照降低了 8. 66%。

　　沙芦草稃壳各相浸提液对白菜种子发芽率的抑制作用由大到小依次为：乙酸乙酯相>水相>甲醇相>丙酮相>乙醚相>石油醚相。水相对白菜根长及苗高的抑制作用最大，其根长和苗高仅为对照的 8. 54% 和 54. 68%;沙芦草稃壳各相溶液对白菜根长的抑制作用由大到小依次为：水相>乙酸乙酯相>甲醇相>丙酮相>石油醚相>乙醚相;对白菜苗高的抑制作用由大到小依次为：水相>乙酸乙酯相>乙醚相>石油醚相>甲醇相>丙酮相，且各相溶液对白菜幼苗根长的抑制作用强于对苗高的影响。各相浸提液对白菜种子萌发存在抑制作用，其中水相对白菜生长的抑制作用最强。说明沙芦草稃壳存在抑制种子萌发的物质，且大部分都为水溶性的。

　　2. 4 沙芦草稃壳各相浸提液提取的有机化合物种类及相对含量沙芦草稃壳石油醚、乙醚、乙酸乙酯、甲醇和丙酮相提取物经 GC-MS 分析的离子流程，通过检索质谱系统与标准谱图对比，筛选总离子流色谱图中峰面积较大、相似度大于 85% 的有机化合物。

　　乙酸乙酯相中共检测出 6 类，共 14 种有机化合物，其中，醇类有 6 种物质，相对含量占 28. 04%;酮类有 1 种物质(1，3-二氧戊环-4-酮)，相对含量为 19. 19%;烷类有 2 种物质，相对含量为 18. 66%;酰胺类有 1 种物质(己酰胺N-四氢糠基)，相对含量占 13. 16%;苯类有 2 种物质，相对含量为 5. 22%;酯类物质有 2 种，含量为 8. 36%。甲醇相中，共检测出 15 种有机化合物共 5 类物质，其中醇类有 5 种，相对含量为 30. 97%;酮类有 2 种物质，相对含量占 23. 73%;烷类有 3 种物质，相对含量为 17. 38%;酯类物质包含 3 种，占总物质的 14. 93%。

　　还有 2 种物质为酰胺类，相对含量为 12. 99%。石油醚相中，共有 8 类物质，其中缩醛类物质含量最高，有 1 种缩醛物质(N，N-二甲基甲酰胺乙缩醛)其含量为 38. 97%;其次为醇类物质包含 4 种，相对含量为 22. 82%;烷类物质有 2 种，共占总含量的 10. 00%;2 种酰胺类物质，含量为 9. 44%;苯类物质有 2 种，含量为 7. 44%;酯类物质包含 2 种，含量为 4. 77%;其中酮类、酸类物质各有一种，含量分别为 4. 39%、2. 17%。

　　乙醚相中，包含 7 类共 15 种有机化合物，含量最高的为醇类包括 4 种物质，相对含量为 21. 83%;其次为酚类物质有 2 种，分别为 2，6-二叔丁基对甲酚和 2，4-二叔丁基苯酚，相对含量分别为 5. 91% 和 20. 41%;烷类物质包含 3 种，相对含量为 15. 90%;共有 1 种苯类物质，占总物质含量的 9. 32%;酯类物质共有 3 种，占总物质含量的9. 43%;酮类、酰胺类物质各有一种，含量分别为 6. 90%、10. 30%。

　　丙酮相中，包含 15 种共 6 类物质，其中酮类物质含量最高共有 3 种，相对含量为 39. 37%;其次为醇类物质共有 5 种，总相对含量为 21. 13%，烷类物质包括 2 种，总相对含量为 14. 82%;酯类物质共有 3 种，含量为 14. 58%;酰胺类和苯类各包含一种物质，相对含量分别为 9. 57%、0. 53%。将各相筛选出离子流程图中相似度大于 85% 的化合物整理，在 5 种有机相中共浸提出 32 种有机化合物，其中有 7 种物质是相同的，分别是 1，1-二丁氧基丁烷、2，2'[- 1，4-丁二基双(甲醛)]双丁烷、2-甲基-3-己醇、4-丁氧基丁-1-醇、邻苯二甲酸二乙酯、己酰胺 N-四氢糠基和 1，3-二氧戊环-4-酮。这 7 种物质分别在各相中总抑制物质的相对含量为石油醚相占 35. 20%、乙醚相占 52. 07%、乙酸乙酯相占 72. 99%、甲醇相占 50. 85%、丙酮相占47. 98%。说明这 7 种物质可代表沙芦草稃壳中的主要抑制物质。

　　3 讨论

　　休眠是指在合适的条件下，有活力的种子不能发芽的现象。种子休眠原因大致可分为种皮障碍类、胚与种子休眠及抑制物质的存在。植物种子中存在的内源抑制物质是对种子休眠影响较大的因素之一，自然界大多数植物种子中都含有萌发抑制物[22]，并且抑制物质分布广泛。在植物果实与种子各部位均存在，不同部位中的抑制物质其含量与种类也存在差异[23]。要确定内源抑制物的存在，通常将种子各部位用甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂浸提，并通过浸提液对白菜等非休眠植物种子进行发芽实验，以此来判断抑制物质的存在[24]。

　　本研究对抑制沙芦草种子发芽部位进行试验，结果表明沙芦草稃壳可显著抑制其种子的发芽率，说明沙芦草的稃壳中可能存在抑制物质。朱铭玮等[25]采用系统溶剂分离法对凤丹(Paeonia ostii)种皮和种胚的浸提液进行分离，测定各提取相的生物活性，结果表明凤丹种皮和种胚的乙醚相的抑制作用最强，判断该种子乙醚相鉴定出的物质可能与其生理休眠有密切关系。

　　刘序等[26]以白菜种子为指示植物，萃取出香榧(Torreya grandis)种子 3 个部位的内源物，并对其进行了生物测定，结果表明其种子 3 个部位甲醇萃取液处理白菜种子无一粒发芽，抑制作用最强，其次为乙酸乙酯相;邹雨婷等[16]分离出绿山楂(Crataegus pinnatifida)种子的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相，并利用白菜籽发芽试验对这 5 个相进行生物活性测定，结果表明各相对白菜种子的发芽均有一定的抑制作用，抑制作用最强的是乙醚相，其次是甲醇相。本试验采用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮及纯水浸提沙芦草稃壳，以白菜种子为受体材料对其进行生物活性的测定。

　　结果表明各浸提液对白菜种子发芽率、根长和苗高均有不同程度的抑制作用，而各相抑制作用表现存在差异的原因可能是各相中存在的萌发抑制物种类或含量有所不同[7]，其中水相浸提液对白菜种子萌发和生长的抑制作用最大，说明沙芦草稃壳中大部分的抑制物质为水溶性，其次是乙酸乙酯相、甲醇相，这与前人的结果基本一致。本研究通过各有机溶剂浸提沙芦草稃壳，测定白菜种子的生长情况，结果表明沙芦草种子稃壳浸提液对白菜幼苗根长的抑制作用强于对其苗高的影响，说明沙芦草种子稃壳中的抑制物质对幼苗地下部分的抑制作用更强，这与前人[17，27]的试验结果一致。

　　抑制物质是植物种子中存在的一些化学物质，其参与并且影响某些与种子萌发有关的生理代谢活动[28]，当这种影响达到一定程度时即会导致植物种子萌发受到抑制。植物体内的内源抑制物质种类复杂，约有 100 多种，如醛、酚、有机酸、内酯等[29]，而常见的内源抑制物质有脱落酸、2，6-二叔丁基对甲酚、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸等，其主要通过限制胚根生长和分化，诱导芽休眠，从而抑制种子萌发[30]。

　　许多学者对存在于植物种子中的发芽抑制物质做了大量的研究，钱存梦[31]对乌桕(Sapium sebiferum)种子休眠的研究中证实了 2，6-二叔丁基对甲酚是重要的内源抑制物。本试验中，在乙醚相中也检测出了 2，6-二叔丁基对甲酚和 2，4-二叔丁基苯酚，且酚类物质占乙醚相检测所有物质的 26. 32%。蔡梦可[32]对花梨木(Dalbergia odorifera)类木材的耐腐性机理的研究中也发现了芥酸酰胺，认为其对真菌的活性有一定抑制作用。

　　本次试验中各有机相均有酰胺类物质的存在且含量较高，酰胺类物质在石油醚相中的含量为 9. 44%、在乙醚相中的含量为 10. 30%、在乙酸乙酯相中的含量为 13. 16%、在甲醇相中的含量为 12. 99%，以及在丙酮相中的含量为 9. 57%，因此酰胺类物质对沙芦草种子萌发的影响需要深入研究。赵燕[17] 对滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)不同部位不同分离相 GC-MS 分析鉴定结果表明，滇重楼种皮与胚乳中存在多种有机化合物，主要为有机酸类、酯类、烷类、酚类等化合物。刘序等[26]对香榧种子的外种皮、内种皮和胚乳的 GC-MS 检测结果表明，有多种内源物，主要物质有烷类、酚类、醇类、酸类等。

　　本研究中，利用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、甲醇和丙酮等有机溶剂浸提沙芦草稃壳，并通过 GC-MS 分析检测各相浸提液，结果表明 5 种有机相中共检测到 32 种有机化合物，包含烷类、醇类、酯类、酮类、苯类、酰胺、缩醛、酸类和酚类等，其中含量最高的分别为醇类、酮类和烷类物质，这与前人的研究结果大致相同。从以上检测出的结果可知醇类、酮类和烷类可能是沙芦草稃壳上抑制物质的主要组成成分，也有可能是这几种物质相互作用从而导致沙芦草种子的休眠。由于 GC-MS 分析技术只能确定某一物质的相对含量，不能确定其实际含量，因此今后有必要继续对造成沙芦草稃壳休眠的抑制物的含量进行测定。

　　4 结论

　　沙芦草种子发芽部位抑制试验结果表明，去稃处理显著提高了沙芦草种子发芽势及发芽率，说明沙芦草种子发芽主要由稃壳抑制;各相浸提液的生物活性测定表明对白菜种子发芽率的抑制作用由大到小依次为：乙酸乙酯相>水相>甲醇相>丙酮相>乙醚相>石油醚相;通过 GC-MS 检测，发现沙芦草种子稃壳中存在烷类、醇类、酯类、酮类、苯类、酰胺、缩醛、酸类和酚类等 9 类 32 种有机化合物，其中醇类、酮类和烷类物质的含量相对较高，且大部分为水溶性物质，沙芦草种子稃壳中存在的醇类、酮类和烷类等可溶性物质是引起沙芦草种子休眠的主要原因之一。

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　　作者：于金田 1，2，王晶 1，2，伏兵哲 1，2，高雪芹