定量工程生物学的化学蛋白质组学支撑性技术

　　摘要定量工程生物学是一门前沿交叉学科,通过设计-合成-测试-学习-再设计路线将不同的生物元器件组合,形成可以执行特定功能的基因线路,再经过不断优化获得稳定的、可控的基因线路,最后将设计优化后的线路引入不同的生命体,以达到预设的目的.这种变革性的方法可以创建一些能够灵敏感知和响应各种环境的工程系统,但在其中的功能检测环节,化学蛋白质组学技术则成为了测试工程改造生物功能和探究其作用机制的重要工具.随着以非天然氨基酸嵌入、生物正交化学、高分辨率质谱等技术为手段的化学蛋白质组学方法的发展,在复杂环境中解析工程生物的蛋白质组时空动力学变化成为可能,为探究工程改造菌或工程改造细胞的工作原理及其在生物体内的作用机制提供了必要的技术支撑,也为定量工程生物学研究中所需的深度功能测试提供了有效方法.本文主要是概述化学蛋白质组学技术在定量工程生物学研究中的潜在应用.

　　关键词定量工程生物学,基因线路,化学蛋白质组学,生物正交化学

　　自20世纪末以来,生命科学发生着日新月异的变化.生命科学也逐步由定性、局部性的研究向定量、系统化、工程化的方向发展,定量工程生物学(quantitativeengineeringbiology:即通过理性设计和精准地导入人工系统来定量地认知生命机制,践行“造物致知”[1])应运而生.定量工程生物学基于对现有生命系统或各种元器件功能的认识,按照工程化的设计原理对生命系统进行简化处理,以最优化的方式重新编程,构建出多种优化的基因线路,使其发挥预先设定的功能.例如,生产新型生物能源和生物材料、合成多种临床药物以及特异性杀伤肿瘤细胞等.另一方面,工程生物学以超越自然进化法则的方式对天然的生物系统进行人工干扰、重建甚至创造新的生命体,并以此研究复杂生物系统的运行规律以及生物进化的历程.定量工程生物学在临床疾病治疗、化工生产等领域的广泛应用彰显出其强大的适应性.

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　　但有一个问题不容忽视,即将设计、优化后的基因线路放在底盘细胞中,对细胞自身的正常生长以及细胞所处微环境是否有影响,有哪些影响?工程改造的细胞能否像天然细胞一样,在其所处的微环境中正常生长,拥有正常的细胞通讯功能,还有待进一步验证.蛋白质是生物功能的执行者,生物体内蛋白质处 于动态变化的状态,生物体通过调控蛋白质的合成和降解的速率以及翻译后修饰来适应其体内外环境的变化.因此想要对生命的复杂活动有全面而深入的认识,必然要在整体、动态网络的水平上对蛋白质进行研究.近些年来,随着化学蛋白质组学的发展,高分辨率质谱技术的进步以及计算机算法的革新,使得我们能够以高通量水平从复杂的生物样品中鉴定和定量数千种蛋白质,获取生物体蛋白质组的动力学信息,进而得以解析各种生命活动的生物学机制,能够更加深入地理解生命体,为定量工程生物学研究中所需的深度功能测试提供了强有力的技术支撑.

　　1工程生物的蛋白质组时空动力学

　　随着工程生物学的快速发展,诸多人工改造的工程生物面世.这些工程生物有些可以为人类生产复杂的有机分子,有些则有助于人们对于生命奥秘的探索.以酵母细胞作为底盘细胞的研究为例.2003年,Keasling实验室[2]将带有10个酶的合成通路装载到大肠杆菌中,实现了青蒿酸(青蒿素的前体)的合成.随后他们又将该合成途径优化后引入到发酵效率更高的酵母体系中,实现在酵母菌中生产抗疟疾药物青蒿素,并于2013年实现了量产[3].斯坦福大学的Smolke团队[4]将合成阿片类药物的5个基因导入酵母基因组,实现在酵母细胞中生产阿片类药物.2018年,中国科学院上海植物生理生态研究所的覃重军课题组与纽约大学的Boeke团队[5,6]发表了关于酵母染色体融合重塑基因组结构的研究成果,分别将酿酒酵母的16条染色体融合为1和2条染色体.研究表明,重塑基因组结构的酵母细胞与野生型酵母具有相似的转录组水平及表型.

　　2019年,Keasling团队[7]将大麻中的相关基因插入啤酒酵母,使得酵母能够利用半乳糖合成四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD),实现在酵母中生产“大麻啤酒”,该研究有望帮助生物制药公司以较低的成本、批量生产大麻中的各种化学成分.虽然近20年工程生物学的研究与应用已经取得了令人瞩目的成果,但是我们对于工程生物本身还知之甚少,这严重影响着对工程生物的广泛开发及其工业化应用.目前关于工程微生物的研究主要局限于通过观察表型或者转录组分析,而蛋白质是生物功能的执行者,因此基因组、转录组信息不能准确展现工程生命体的信息,并且生物体内蛋白质合成和降解处于动态变化的状态,当机体处于应激条件下或者其所处的内外环境发生变化时,蛋白质组会发生瞬时变化,既有大量新合成的蛋白质,又有一些蛋白质会发生快速降解.因此我们可以利用化学蛋白质组学技术研究工程生物的蛋白质动力学,加深对工程生物的认识.

　　下面将从3个层面阐述用于研究蛋白质组动力学的化学蛋白质组学技术.1.1定性鉴定新合成的蛋白质组非天然氨基酸嵌入技术最早由Schultz团队[8]提出,已有30多年的历史.随后,以Schultz实验室为代表的多个团队创建了原核及真核生物遗传密码子扩增的方法学[9~12],将带有多种不同报告集团(如荧光素、光交联基团、细胞毒素等)的非天然氨基酸位点特异性地嵌入新合成的蛋白质[13~15].2006年,Dieterich等人[16]提出生物正交非天然氨基酸标记(bio-orthogonalnoncanonicalaminoacidtagging,BONCAT)策略,用于亲和富集、鉴定细胞中新合成的蛋白质[17,18].利用细胞内源性翻译机制,将带有生物正交基团的非天然氨基酸嵌入到新合成的蛋白质中[19],生物正交基团作为代谢标签对蛋白质进行化学标记,将新合成的蛋白与预先存在的蛋白区分开来,从而降低了样品的复杂度[16,20].

　　在蛋白质合成过程中,位点特异性地向蛋白质中加入带有化学探针的非天然氨基酸[21],赋予被标记的蛋白独特化学功能.随后利用生物正交基团的特性,通过Cu催化[3+2]叠氮-炔基环加成反应[22,23]对新合成的蛋白质进行选择性分离纯化、富集,或者通过荧光成像等手段观察蛋白质的动态变化[17,18].BONCAT不仅可以用作狭义蛋白质组学(即基于质谱分析的蛋白质组研究)的研究工具,也可以用作广义蛋白质组学研究(例如基于荧光成像[24]的新生蛋白质组学研究等)的技术手段.类似的概念近年来也被推广到核酸[25,26]、糖类[27]和脂类[28]的代谢标记等领域中,用于对这些物质进行富集分析、动力学变化检测或高灵敏度示踪.研究证明,BONCAT技术广泛适用于追踪各种模型系统中新合成的蛋白质,例如细菌[29]、哺乳动物细胞[30,31]和斑马鱼等动物模型[32].

　　可用于检测蛋白质组的动态变化[33]、核糖体的转换率[34]以及在活体中原位、可视化监测大鼠海马区神经元中新合成蛋白的动力学变化等[30,35],研究当多巴胺能神经元受到化学刺激时,轴突是怎样做出应激反应以维持自身稳定[36].Schuman团队[32]在活体斑马鱼模型中已成功运用BONCAT技术,实现对复杂神经系统中的新合成的蛋白质进行可视化观察和亲和纯化分析,证明长期记忆的形成过程会伴随大量新的蛋白质合成.Tcherkezian等人[30]观察到结直肠癌缺失基因受体(deletedincolorectalcarcinoma,DCC)与蛋白质合成位点的共定位,为纺锤体蛋白作为刺激神经元中核外蛋白质产生的作用提供了支持.

　　1.2定量分析新合成的蛋白质组

　　为了克服BONCAT时间分辨率不足,以及不能对蛋白质组进行定量分析的技术限制,Acuto团队将BONCAT技术[16]与SILAC(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture,即在细胞培养的过程中,在培养基中加入稳定同位素标记的氨基酸,经过细胞代谢过程,使得蛋白带上同位素标签)技术[37]联用,将它们的优势结合在一起形成定量非天然氨基酸标记策略(quantitativenoncanonicalaminoacidtagging,QuaNCAT)[38].Bagert等人[39]在HeLa细胞中联合使用BONCAT和pSILAC技术(pulsedSILAC,是指在较短的时间段内(从5min到若干小时)对蛋白质进行脉冲式的SILAC标记),在30min的脉冲标记的时间区间内,成功鉴定到1484种新合成的蛋白.

　　这是单独使用同位素标记技术无法达到的时间分辨率.Howden等人[38]利用QuaNCAT技术检测当原代T细胞经过佛波酯和离子霉素共刺激后,T细胞蛋白质表达组的变化.BONCAT技术与SILAC技术联用,通过将新生蛋白亲和纯化标签与蛋白质谱定量标签两种代谢插入相结合,有助于评估细胞蛋白表达量的短时应激变化,具有更高的定量准确度和检测灵敏度.克服了BONCAT技术定量鉴定的准确性较低,以及SILAC技术标记时间长且仅适用于研究稳态蛋白质组的变化的缺陷.QuaNCAT技术不需要对细胞或生物体进行饥饿处理,减少了对样品造成的干扰,因而所测得的数据能更好地反映真实的生理条件下蛋白质的动态变化情况.

　　2复杂环境中解析工程生物的蛋白质组

　　近年来,工程生物学在临床疾病治疗领域应用越来越广泛,在肿瘤、代谢病、重大传染病等方面已经取得了引人注目的研究成果,并有望解决目前临床面临的诸多难题.通过工程生物学改造的细菌可以提高其靶向肿瘤、有效荷载外源基因的能力,使肿瘤的细菌疗法焕发生机.例如,在细菌体内安装群体感应(quorumsensing,QS)开关调控的基因线路,只有当细菌种群达到阈值密度时才能激活效应基因的表达,该线路能够有效提高细菌靶向肿瘤细胞的特异性[50~52].

　　对于工程改造的沙门氏菌,利用其T3SS分泌系统向肿瘤细胞递送抗血管生成蛋白,可有效抑制体内肿瘤的生长[53,54],或者将工程菌上的肿瘤相关抗原传递给抗原呈递细胞,激活免疫细胞从而引发抗肿瘤免疫[55].2019年,哥伦比亚大学TalDanino课题组[56]对大肠杆菌进行改造,作为递送免疫治疗药物的载体,协助免疫系统从内部攻破肿瘤.相较于肿瘤的细菌治疗,溶瘤病毒(oncolyticvirus,OVs)在临床应用上已经先行一步,它们具有裂解肿瘤特异性细胞和激活免疫反应的能力,可作为潜在的原位肿瘤疫苗.

　　3前景与展望

　　近些年来,定量蛋白质组学研究技术的发展,使得研究人员能够以前所未有的时间和空间分辨率监测蛋白质合成,研究内在外环境发生变化时,生物体在极短时间内的应激反应.利用现有的化学蛋白质组学技术获取生物体的蛋白质组动态变化的信息,进而深入探究各种生理病理现象的生物学机制,推动定量工程生物学的发展.

　　促进药物研发、早期临床诊断,成为临床疾病诊断及治疗的强有力辅助工具.蛋白质组学的研究技术目前还存在诸多不完善之处,新型定量蛋白质组学技术正处于研发阶段,期待在不久的将来,技术的发展可以实现在单细胞水平上监测生物体的生理和病理状态及其蛋白质组的动态变化;以利于筛选疾病的生物标记物,获取特定细胞的分泌组,用于疾病的早期临床诊断;为研究定量工程生物学中新改造的生物体提供方法支撑,使得科研人员可以在系统层面上进行深度功能测试,促进工程生物学的产品转化;更好地推动定量工程生物学、生物医学及临床医学的发展.

　　参考文献

　　1ZhangXE.SyntheticbiologyinChina:Reviewandprospects(inChinese).SciSin-Vitae,2019,49:1543–1572[张先恩.中国合成生物学发展回顾与展望.中国科学:生命科学,2019,49:1543–1572]

　　2MartinVJJ,PiteraDJ,WithersST,etal.EngineeringamevalonatepathwayinEscherichiacoliforproductionofterpenoids.NatBiotechnol,2003,21:796–802

　　作者：王蕾1,2†,黄建东1†,杨舒心1,黄术强1,2*,李楠1,2*