面粉中过氧化苯甲酰检测方法的研究进展

　　摘要：过氧化苯甲酰的使用存在着一定的安全隐患。因此应当建立一个有效的测定方法。通过对过氧化苯甲酰常用的检测方法(气相色谱法、高效液相色谱法、分光光度法等)以及新方法(傅里叶红外光谱法、拉曼光谱法等)的介绍，为相关部门检测以及过氧化苯甲酰检测方法的研究提供一些参考。

　　关键词：过氧化苯甲酰;苯甲酸;面粉;增白剂;检测方法

　　农业方向论文投稿刊物：《粮食加工》(西部粮油科技;陕西粮油科技)1976年创刊，20多年来，始终围绕着办刊宗旨，向全国粮食战线的广大职工和科技人员传播信息，提供相互交流，共同探讨粮油工业发展的园地。在西部大开发中，紧紧围绕国家政策，及时报道西部粮油工业的新动态、新发展、为我国粮油工业的发展做贡献。

　　过氧化苯甲酰(C14H10O4)的全称为过氧化二苯甲酰，俗名引发剂(benzoylperoxide，BPO)，是一种白色晶体粉末，微溶于水和乙醇，能溶于苯、乙醚、氯仿等，是一种强氧化剂，过氧化苯甲酰(BPO)被广泛用于化学工业，性质及其不稳定，高温、撞击等会引起爆炸[1-3]。在食品方面，BPO曾是我国允许使用的食品添加剂。

　　作为面粉增白剂，过氧化苯甲酰有一定的色泽改善作用：新磨制的面粉中存在着少量的胡萝卜素和叶黄素，分子结构内存在着发色基团共轭双键，在面粉中添加过氧化苯甲酰后，胡萝卜素和叶黄素的共轭双键被活性氧氧化，增加了面粉的白度。此外，添加过氧化苯甲酰还有加快面粉后熟的作用：新磨制的面粉内的巯基半胱氨酸具有激活蛋白酶的作用，使面粉中的组织不匀，粘性增加，若加入过氧化苯甲酰，则可使面粉加快后熟，减少霉变从而延长保质期[4-6]。过氧化苯甲酰的添加还可以间接的提高面粉的出粉率，若添加60mg/kg的过氧化苯甲酰在面粉中，则出粉率可提升3%，白度提升4%~6%[7]。所以这些优点使其在20世纪80年代在我国被广泛的使用。但食用过量的过氧化苯甲酰会对身体造成损害，动物实验表明，过量或长期食用过氧化苯甲酰对小鼠的肾脏造成了巨大的损伤，还能诱发癌症，降低雄鼠的体重和生殖能力。BPO还会对维生素造成破坏[8]。

　　经长期研究发现，BPO可能是潜在的肿瘤诱导剂，可对人外周淋巴细胞产生遗传毒性作用，食用过量的BPO容易引发皮肤紫斑、牙龈出血等症状，还会引起角膜炎、神经炎、口角炎等疾病。面粉中的过氧化苯甲酰在放置的过程中还容易逐渐转化为苯甲酸，有些人在接触苯甲酸时会出现过敏症状，因此BPO的添加以及添加量一直倍受争议[9]。1996年，《食品添加剂使用卫生标准》中明确指出，0.06g/kg为过氧化苯甲酰的最大使用量[10]。后根据《卫生部撤销面粉增白剂过氧化苯甲酰公告》[11]，从2011年5月1日开始，全面禁止过氧化苯甲酰的添加，所以应当重视对面粉中过氧化苯甲酰含量的测定。

　　我国的标准检验方法为气相色谱法、高效液相色谱法和氧化还原滴定法。这些方法都比较费时、繁琐，对于过氧化苯甲酰含量较少的样品测量不准确，在选择方法时应考虑到方法的检出限、测量时间、准确性、是否能进行现场检测等，且只以过氧化苯甲酰为目标物检测是非常不准确的，过氧化苯甲酰的性质及其不稳定，容易受光、热等影响而分解[12]。本文对过氧化苯甲酰测定方法的研究进展进行了全面的阐述，目的是使其深入了解过氧化苯甲酰的检测方法，可通过不同方法的比较来选择合适的方法，从而推动广大学者对过氧化苯甲酰的检测方法进行深入研究。

　　1面粉中过氧化苯甲酰的测定方法

　　1.1气相色谱法(gaschromatography，GC)

　　气相色谱法是将气体作为流动相的色层分离分析方法。该法依据为国标GB/T18415-2001《小麦粉中过氧化苯甲酰的测定》[13]。其原理为使过氧化苯甲酰转换为苯甲酸，再用乙醚将其提取，以氯化钠溶液洗涤净化后加入碱性氯化钠生成苯甲酸钠，再加入盐酸反应生成苯甲酸，加入石油醚-乙醚溶液提取，最后用气相色谱仪测定。但该法前处理较复杂，测定时间较长，所以，研究者们在国标法的基础上进行改善。钱凯等提出了一种新的测定方法，原理是盐酸和还原铁粉反应产生的原子态氢使面粉中的过氧化苯甲酰还原为苯甲酸，然后对其提取净化后用气相色谱仪进行测定，再与标准系列比较定量。此法的回收率为96.7%，稍高于国家标准方法，该方法省略了国标法中多次洗涤的过程，简化了前处理步骤[14]。

　　章沙沙则是在面粉中加入一定的酸性石油醚，使过氧化苯甲酰还原为苯甲酸，再用毛细管气相色谱柱分离后将其用气相色谱仪氢火焰离子化检测器进行检测，提出了气相色谱快速检测食品中的过氧化苯甲酰的方法，此法的检出限是3mg/kg，精密度为2.83%~6.20%，回收率为94.00%~104.00%。此法降低了前处理的步骤，结果更加准确，并且可测大量样品[15]。但气相色谱法操作较繁琐并且对仪器要求较高，注意事项多，同时也不确定是否过氧化苯甲酰是否全部还原为苯甲酸。

　　1.2高效液相色谱法(highperformanceliquidchro-matography，HPLC)

　　高效液相色谱法是以液体为流动相的分析方法，该法采用高压输液系统将样品分离后进行检测，是一种区别于经典的液相色谱，以仪器分析方法为基础的高效能分离手段。特点为高压、高效、高速、高沸点、且其灵敏度也较高，用途比较广泛。GB/T22325-2008《小麦粉中过氧化苯甲酰的测定》中是先用甲醇提取面粉中的过氧化苯甲酰，再用碘化钾将过氧化苯甲酰还原成苯甲酸，再用高效液相色谱柱进行分离而测得。但是，大量的加入碘化钾不仅对液相色谱柱造成极大的损害，还会在分离时会在测定物出现之前先出现一个峰，会对测定物的分离造成不利影响。所以，对提取剂的选择极为重要。高艾英对面粉中过氧化苯甲酰以及其还原产物苯甲酸含量的动态变化进行研究，结果表明面粉中的过氧化苯甲酰在放置的过程中会逐渐转化为苯甲酸[16]，所以国标中的测量方法会引起误差。现在大都直接将样品中的过氧化苯甲酰和苯甲酸在一定时间内提取出来进行测定。一般来说主要的提取液有石油醚、乙醚等。

　　但乙醚等非极性溶剂虽然可以溶解过氧化苯甲酰，但会引入杂质，对试验干扰较大。还有文献显示可以用有机溶剂与水混合来提取，但是这种做法会引入杂质并导致过氧化苯甲酰的加速分解，带来严重误差。吴泽玉等采用甲醇为提取液，甲醇和0.2%冰醋酸为流动相，反相C18柱进行分离，结果表明该试验线性回归系数为0.9998和0.9995，线性关系良好，相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)值为2.5%和1.1%，回收率为91.1%~104.0%，该法灵敏度较高，准确性较好[17]。

　　而许秀敏等则选择无水乙醇作为提取剂，方法灵敏可靠[18-19]。徐跃成等用乙腈作为提取试剂并用高效液相色谱法直接同时测定，结果表明该方法检出限苯甲酸为1.0mg/kg，BPO为0.5mg/kg，RSD值分别为0.9%和3.0%，回收率分别为91.2%~100.4%，此方法能更准确的测定其含量，避免了定性定量的缺陷[20]。1.3薄层色谱法(thinlayerchromatography，TLC)薄层色谱法又称为薄层层析，就是把固定相涂布于支持物上，形成一层均匀的膜，再用点样器点样，然后用合适的溶剂展开，根据比移值(Rf)与对照物按照同法所得的色谱图比移值(Rf)做对比，用于定性、定量分析。薄层色谱法使用的装置的独立的，可对每个单元进行单独操作。通常在大气压或接近大气压下进行，并支持离线操作。该方法其成本低、使用简单、便于现场使用并且曲线简单易学的特点而被应用[21]。

　　腾云先用无水乙醇把过氧化苯甲酰(BPO)从面粉中提取出来，然后在酸性条件下，Fe2+被BPO氧化为Fe3+，Fe3+可与邻菲罗啉试剂发生褪色反应，从而采用TLC法进行测量。结果表明：在一定范围内，褪色反应与BPO含量呈良好的线性关系，回归方程为y=0.388x+0.0029，r=0.997[22]。但该法只适用于刚出厂的面粉，对放置时间过长的面粉的检测会出现结果偏低的状况，并且薄层色谱法一般用于定性分析，其测定的结果的稳定性和重现性较差，一般展开剂毒性较大。

　　1.4分光光度法

　　分光光度法是利用被测物质在一定的波长范围内有特定的光的吸收度或发光强度的特性来对被测物质进行定性、定量分析的一种测定方法。该方法的特点是操作比较简单、检测时间较短、灵敏度高，且仪器较为常见。是目前较常用的检测方法。沙鸥等建立碘化钾-吖啶红分光光度法，本法采用甲醇将BPO提取出来，在与过量的碘化钾反应生成I3-，在硫酸介质中，与吖啶红以形成离子缔合物，在一定范围内，BPO的浓度与吸光度呈线性关系，回归方程为y=0.388+0.127x，线性相关系数为0.998，回收率在98.0%以上，相对标准偏差小于1%，精密度较高，满足分析要求[23]。KraingkraiPonhong等则是采用了乙醇作为提取剂，再使BPO与2，2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐反应得到蓝绿色产物，然后通过分光光度计进行检测。

　　该方法的检出限(limitofdetection，LOD)为0.025mg/L，相对标准偏差小于2%，回收率为87%~104%，成功建立一种简便、快速、灵敏的方法[24]。为提倡环保，Sam-angSupharoek等采用简单的顺序注射分光光度法，采取南瓜天然试剂代替化学品作为提取物，该方法绿色环保、化学品消耗低[25]。不过分光光度法也只适用于新出厂面粉的检测，市面上的面粉中有一部分过氧化苯甲酰已转化为苯甲酸，易造成测定结果偏低的情况。

　　1.5荧光分析法

　　荧光分析法就是利用某些物质被外来辐射照射后处于激发态，激发态分子激发能反映出该物质特性的荧光，然后进行定性和定量分析。该方法是比较先进的检测方法，其特点为设备简单、操作简便且选择性强、灵敏度高。早期WeiChen等先用BPO将Fe2+氧化为Fe3+，然后用罗丹明衍生物(N-methoxyrho-damine-6Gspirolactam)作为荧光探针，从而开启检测系统的荧光，建立了一种快速、灵敏的测定面粉中BPO的方法。结果表明该方法的检出限为6mg/kg，成功应用于对小麦粉中过氧化苯甲酰含量的测定[26]。QiaoHu等则是制备基于香豆素的荧光探针，用于快速和目视检测食品中的过氧化苯甲酰[27]。

　　但探针分子是通过有机方法合成的，反应系统和样品制备会消耗大量试剂，反应时间也比较长。陆治名等用无水乙醇作为溶剂，吐温-80增敏，建立分散液相微萃取-表面活性剂增敏荧光联用技术。结果表明BPO浓度与其荧光强度呈良好的线性关系，回归方程为y=16.007x+12.803(r=0.9993)，检出限为0.2028mg/kg，回收率大于96.9%，该方法有效提高了灵敏度，简化前处理过程，适用于新生产面粉中BPO含量的测定[28]。但该方法易受干扰，所以推广使用上受到限制。

　　1.6电化学分析法(electrochemicalanalysis，EA)

　　电化学分析法又称为电分析化学法，其原理是利用物质在溶液中的电化学性质变化规律，以电流、电位、电导、电量等电学量与待测物之间的关系为基础，对待测组分进行定性、定量分析。该方法的特点为仪器简单、灵敏度较高、测量的范围较宽、准确度较高等。所以近年来很多学者采用该方法来进行检测。王春燕等以对羟基苯硼酸为反应物，使其与过氧化苯甲酰反应，生成化学探针对羟基苯酚，然后对对羟基苯酚的电化学信号进行检测来间接测定面粉中过氧化苯甲酰的含量，成功建立一种新的间接电化学检测方法。

　　试验结果表明其还原峰电流和过氧化苯甲酰的浓度呈一定线性关系，回归方程为(IμA)=0.2750+0.00243c(μmol/L)，r=0.991，检出限为0.2μmol/L，回收率为94.5%~103.5%，并有良好的稳定性和重现性，和气相色谱法和液相色谱法相比，此方法更快速、成本较低[29]。但对羟基苯硼酸为刺激性物质，刺激眼睛、皮肤和呼吸道等，使用时应带手套和防护眼镜等。

　　1.7化学发光法(chemiLuminescence，CL)

　　化学发光法的原理是在一定条件下，体系的发光强度和待测物浓度呈一定的线性关系，通过仪器检测该体系化学发光强度，从而确定待测样品含量的一种分析方法[30]。该方法的特点是检测的灵敏度极高，并且选择性好、测定的线性范围较宽。彭祥等利用血色素有一定催化作用和催化效率的特性，将其作为BPO和鲁米诺反应的催化剂，结果表明其相对发光强度与BPO浓度具有良好的线性关系，回归方程为y=2.215×108x+2.401×10(8r=0.9992)，检出限为6×10-11mol/L，回收率大于95.4%，有效提高了反应的灵敏度，降低了检出限，成功的建立了血色素催化鲁米诺化学发光法[31]。

　　但该方法仪器较为复杂，发光机理有待开发。陈小燕等选用了热电子诱导阴极电致化学发光技术(cathodicelectrochemiluminescence，CECL)来检测面粉中的过氧化苯甲酰，工作电极为氧化处理的玻碳电极(CxO1-x)，并在电极上施加-18kV(vs.Ag/AgCl)阴极脉冲电位，最后形成水合电子，BPO在其作用下生成强氧化自由基与鲁米诺发生反应而发光。结果表明该发光强度与BPO浓度线性关系良好，回归方程为y=0.9575x+394.0(r2=0.9976)，检出限为0.7μg/L，回收率大于97.2%，该法和其他方法相比更简单、更灵敏，值得推广[32]。

　　1.8其他方法

　　通过二阶导数光谱分析检测，发现小麦粉中的过氧化苯甲酰在放置的过程中不仅分解为苯甲酸，还会产生其他有害物质，如苯等。Xiao-XiGuo等利用傅里叶红外光谱法(Fouriertransformsinfraredspectrometry，FT-IR)具有宏观识别复杂系统的优势，并且结合二阶导数光谱法(secondorderderivativespectrophotometry，SD-IR)和二维相关红外光谱法(twodimensionalcorre-lationinfrarespectroscopy，2DCOS-IR)，不仅可以揭示样品中的主要成分，还可以区分高相似度的基质中化学成分的种类和含量，成功建立多步红外宏观指纹法。结果表明该法不仅显著提高了光谱的表现分辨率，而且提高了相对强度变化和化学反应等信息，这些信息无法从常规光谱中获得。多步红外宏观指纹图谱分析是一种有效、全面的检测面粉中过氧化苯甲酰的方法[33]。

　　为了简化试验步骤，Wei-PingYang等提出了一种新型的毛细管微滴注射进样-化学发光系统。该法利用重力和气体压力的作用，使液体样本微滴在毛细管尖端自动形成，反复落入微型反应池中并与CL试剂反应产生CL信号。试验结果表明BPO的检出限为1.4×10-10g/mL，成功建立简单、自动化、小型化的方法[34]。比色法由于成本较低、操作简单、实用性强并且可以直接读出所以备受关注，但这些方法仍然存在一些缺点，比如单一的颜色变化会影响分辨率和灵敏度，并且检测时间也很长，所以，应开发一种快速、灵敏的检测方法。JingHu等开发了一种基于3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB)和BPO之间颜色反应的简单比色法，TMB比联苯胺更敏感，危害性更小，既没有致突变性，也没有致癌性，所以可用作新型显色剂。该法利用了BPO和TMB之间的氧化还原反应，在弱酸介质中，TMB可被BPO氧化，产生典型的显色反应，固体由白色变为蓝色。

　　该法的回收率在97%~118%之间，检出限为0.45μg/mL，虽然还不是所有方法中最灵敏的，但它实现了简单方便的检测，并且无需昂贵的仪器，更重要的是，可以在没有任何仪器的帮助下用肉眼来评估[35]。TianranLin等提出了一种基于Au@Ag纳米棒(NRs)表面Ag纳米壳蚀刻的快速、灵敏、高分辨率的BPO比色检测法，BPO可以氧化Au@AgNRs表面的纳米壳，Ag纳米壳的蚀刻改变了Au纳米结构的纵横比，并且导致了纵向局部表面等离子共振(localizedsurfaceplasmonresonance，LSPR)峰被红移，进一步导致鲜明的对比多色变化，纵向LSPR峰值和颜色变化的多少和BPO的浓度有关。

　　此外，该法还利用琼脂糖水凝胶作为视觉检测平台，设计了一种简单、便携的视觉检测试剂盒，在面粉中BPO浓度低至20mg/kg时，肉眼就可以区分颜色变化。结果表明，该法的回收率为92.0%~108.9%，检出限为0.75μmol/L，成功建立了简单、经济的现场检测方法[36]。为了建立一种更无损、更有效的检测面粉中BPO的方法，有些学者使用了拉曼光谱法。

　　拉曼光谱定性分析法是通过看被测物质对应化学键的拉曼特征峰存在与否来确认该物质是否存在。赵娟等基于拉曼光谱技术采集面粉和BPO的纯品拉曼光谱，筛选出了识别BPO的拉曼特征峰在1001cm-1处，该法可以实现去除面粉荧光背景的干扰[37]。YueSun等开发了具有毫米级通道的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)毫流体芯片，有处理样品的多个功能单元，包括萃取、过滤、混合、固相萃取(solidphaseextraction，SPE)等，每个单元可通过泵管和单向阀串联连接，形成全自动系统，完全可应用在对面粉中BPO的检测。此法构建了一个集成仪器来操作毫流体芯片，该仪器通过泵送试剂溶液以流过毫流体芯片，以实现BPO的拉曼光谱检测。该法BPO检出限为0.017g/kg，这种模块化设计被证明是很有效的检测方法，系统小型化，方便携带，可以扩展用于其他食品的预处理[38]。还有一些方法包括碘量法、氧化还原滴定法，但这些方法精密度和准确度较低，分析结果重现性较差。

　　2各种方法的比较

　　一些常用的方法虽然提供了测定过氧化苯甲酰含量的重要指标，但他们具有一些重要的缺点。比如气相色谱法和高效液相色谱法的特异性较差，有时会受到一些羰基物质的干扰，使试验造成误差。有些方法需要复杂昂贵的大型仪器，也限制了它们的实际使用。分光光度法与色谱法相比，操作更简单，并且现已开发出紫外-可见分光光度法的不同检测系统，提高了灵敏度，减少了试剂的消耗，可实现自动化[39]。荧光分析法、电化学分析法和化学发光法的操作过程较为复杂，但灵敏度比色谱法高，可根据需求来选择相应的方法。

　　3结论

　　过量的BPO不仅对面粉中的营养物质造成损害，还会对健康造成一定影响。在面粉的储存和烹饪的过程中，BPO可能会分解成苯甲酸、联苯和苯甲酸苯酯等有害物质，导致组织损伤和潜在的疾病[40]。通过以上对各种方法的讨论可知每个方法各有优缺点，气相色谱法和高效液相色谱法是使用最广泛的常见方法，灵敏度较高，测定较准确，但该方法样品前处理过程较复杂，检测时间也较长，不适合现场检测，分光光度法检测时间短并灵敏度高，而荧光光度法虽然灵敏度高但易受干扰，使用时应注意。电化学分析法和色谱法相比，方法更快速，并能降低成本等。

　　在选择测定方法时要考虑到BPO在放置的过程中会转化成苯甲酸或分解出苯等有害物质，避免造成测定结果偏低的状况，还要考虑到使用的方法是否适合现场检测，可以测定样品多少的问题，本文通过对各个方法的分析，建议使用其他方法中的新方法，对于傅里叶红外光谱法(FT-IR)、拉曼光谱法等质量评估系统的开发，可以保证食品质量的安全，提高广大消费者对食品安全的信心。为了更深入的了解过氧化苯甲酰的化学特性和生物特性，迫切需要更先进的检测技术。所以如何提高产品质量安全并且如何建立一个快速、准确、灵敏、无损的检测方法值得深入研究。

　　参考文献：

　　[1]赵奕斌.化学化工大辞典[M].北京:化学工业出版社,2003:893

　　[2]张明森.精细有机化工中间体全书[M].北京:化学工业出版社,2008:883

　　[3]LuKT,ChuYC,ChenTC,etal.Investigationofthedecompositionreactionanddustexplosioncharacteristicsofcrystallinedicumylperoxide[J].ProcessSafetyandEnvironmentalProtection,2010,88(5):356-365

　　[4]李伟,赵全年,宋卫东.过氧化苯甲酰毒性的研究进展[J].疾病监测与控制,2010,4(7):391-392

　　[5]岳青.面粉中违禁的添加物[J].粮食加工,2012,37(2):19-21