以大豆乳清水为原料提取纯化大豆素的工艺研究

　　摘要:以碱提酸沉工艺生产大豆分离蛋白过程中排放的大豆乳清水为原料，经过沉降分离、碳酸钠分层分离、乙酸乙酯萃取后，旋转蒸发得固体，再经大孔树脂吸附、洗脱得大豆素。比较了5种大孔树脂对大豆素的纯化作用，发现ADS-21纯化效果最好。经薄层层析扫描法检测，大豆素纯度为98.5%，可作为药品、保健品和检测用标准品。本研究方法可用于大豆素的规模化生产。

　　关键词:大豆乳清水;大豆素;大孔树脂;提取;纯化;薄层层析扫描法

　　大豆异黄酮具有较为广泛的生物活性，由大豆素及其苷、染料木素及其苷、黄豆黄素及其苷组成，具有抗癌(如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等)[1]、抗老年痴呆、抗衰老、提高机体免疫力[2-3]、抗辐射[4]、抗菌[5-6]等作用，其中苷质量分数占97%以上[7]。研究表明，苷在体内微生物(乳酸菌、双歧杆菌等)酶的作用下可水解成苷元(主要是染料木素和大豆素)，被小肠吸收[8]。

　　大豆异黄酮各组分中能够产生生理活性的是苷元，其医疗价值主要来源于苷元形式[9-10]。另外，染料木素和大豆素虽然都是大豆异黄酮苷元，但染料木素比大豆素更容易被肠道微生物降解，生物利用率低，因此大豆素在发挥生理活性中起主要作用[11]。为制备有生理活性的大豆异黄酮苷元，并进一步分离制备高纯度的染料木素和大豆素，人们一直在不懈地探讨新的技术方法。Nemitz等[10]用索氏抽提器对脱脂大豆进行酸提(1.3mol/LHCl，80℃，0～6h)，制备的大豆异黄酮混合物中苷元占92%。Yoshiara等[12]利用发芽大豆的内源β-葡萄糖苷酶将大豆异黄酮苷转变成苷元后提取，大豆异黄酮混合物中苷元占98.7%。Wang等[13]利用外源β-葡萄糖苷酶将大豆异黄酮苷转变成苷元后，采用高速逆流分配色谱仪制备了染料木素、大豆素和黄豆黄素，3种苷元纯度均在95%以上。Cao等[14]采用离子液和乙酸乙酯进行液-液萃取方法从大豆异黄酮的混合物中制备了染料木素，纯度达到了95.3%。

　　然而这些实验室方法存在着样品处理繁琐，设备或操作条件要求高，所用萃取试剂种类多、不易回收，试剂用量大且成本高、时间长、制样少等问题，难以实现工业化制备高纯度大豆异黄酮苷元单一产品。低温脱脂豆粕经稀碱溶液提取后，可使大部分蛋白质溶出，盐酸调整浸提液酸碱度使蛋白质在等电点析出，分离得到蛋白质凝乳，排出的则为大豆乳清水。这种碱提酸沉工艺在生产大豆蛋白过程中排放了大量乳清水，其中有较多大豆异黄酮随废液排入环境，成为环境干扰因素影响动植物生长。如果将其从中提取出来作为食品、保健品、药品原料或检测用标准品，就会变废为宝，提高大豆乳清水的再利用率，取得良好的经济效益。本文以大豆乳清水为原料，提出了一套可工业化生产具有高活性、高纯度大豆素产品的有效方法。

　　1仪器与材料

　　1.1实验仪器

　　HH-S型恒温水浴锅(江苏省金坛市正基仪器有限公司);CAMAGTLCscannerIII型薄层扫描仪(winCATS1.4.4)软件(瑞士CAMAG公司);JY02G型凝胶成像仪(北京君意东方电泳设备有限公司);EYELA-旋转蒸发仪(EYELA株式会社);10cm×20cmGF254硅胶板(青岛海洋化工有限公司)。

　　1.2实验材料

　　大豆乳清水(山东禹王生态食业有限公司);氯仿、甲醇、乙酸、丙酮、乙酸乙酯、碳酸钠(天津富宇精细化工有限公司)，分析纯;黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、黄豆黄素、大豆素、染料木素(北京索莱宝科技有限公司)，色谱纯。

　　2方法与结果

　　2.1方法

　　2.1.1样品溶液制备

　　20L大豆乳清水经自然沉降、分离沉淀后得4L黄色液体。向该液体中加入碳酸钠，使体系中碳酸钠最终浓度为5%。搅拌溶解后静置0.5～1h，取上层黄色溶液，加入该液体体积1/2的乙酸乙酯。搅拌提取0.5～1h，静置分层，分离出上部乙酸乙酯层。旋转蒸发除去乙酸乙酯得膏状物130.2mg。将2gADS-21大孔树脂放入98%乙醇中浸泡24h，湿法装柱(1cm×5cm)。4BV去离子水冲洗掉乙醇后加入膏状物，再用4BV去离子水冲洗掉膏状物中的水溶性物质，4BV95%酒精冲洗黄色带部分，旋转蒸发除去乙醇后得固体产品20mg。HPD600，D4020，D4006，AB-8大孔树脂均各取2g，这4种大孔树脂处理和分离方法同ADS-21。

　　2.1.2大豆异黄酮成分的检测

　　2.1.2.1样品溶液的配置

　　将大豆乳清水及自然沉降的下层液、加5%Na2CO3沉降后的上层液、加乙酸乙酯后的上层液各100mL，旋转蒸发成固体。将5种大孔树脂各自分离得到的黄色液体旋转蒸发成固体。对9种固体物检测苷时，各取2mg分别溶于1mL甲醇，检测苷元时各取2mg溶于1mL乙酸乙酯。将所得产品固体溶解于乙酸乙酯，定容为1.35mg/mL，作为样品溶液备用。

　　2.1.2.2标准品溶液的配置

　　用甲醇分别将黄豆黄苷、大豆苷、染料木苷、黄豆黄素、大豆苷元定容为1.58，1.18，1.09，0.32，1.38mg/mL。用乙酸乙酯将染料木素定溶为1.04mg/mL。

　　2.1.2.3薄层层析扫描方法

　　苷(黄豆黄苷，大豆苷，染料木苷):将样品液和标准液点于同一块高效薄层硅胶板GF254(10cm×20cm)上，展开剂(V二氯甲烷:V甲醇:V乙酸=10:2:0.1)，预平衡20min，将板放入展开缸，上行展开，展开距13cm。苷元(黄豆黄素，大豆苷元，染料木素):将样品液和标准液点于同一块高效薄层硅胶板GF254(10cm×20cm)上，展开剂(V二氯甲烷:V甲醇:V乙酸=93:7:0.5)，预平衡20min，将板放入展开缸，上行展开，展开距13cm。苷和苷元检测的扫描条件:扫描速度80nm/s，扫描间隔200μm，照射灯D2灯，波长260nm，扫描宽度6.00mm×0.90mm。

　　2.1.2.4标准曲线的制备

　　精密吸取大豆异黄酮标准溶液，以梯度点样量点于同一高效薄层硅胶板GF254(10cm×20cm)上，以2.1.2.3方法进行展开、扫描。以大豆异黄酮标准品的质量(μg)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，由薄层色谱仪管理软件winCATS得到线性回归方程。

　　2.1.2.5精密度、重复性、稳定性、回收率检测方法同李成辉等[15]方法。

　　2.2结果与分析

　　2.2.1大豆异黄酮分离结果

　　大豆异黄酮分离，大豆乳清水经过两次沉降分层、乙酸乙酯提取，6种大豆异黄酮成分均逐渐降低。利用5种大孔树脂吸附洗脱来纯化大豆素，产品纯度在89.70%～98.00%。虽然D4020、D4006、AB-8制备的大豆素较多，但纯度相对较低。ADS-21虽然也含有杂质，但其他大豆异黄酮成分未检测到，只洗脱得到大豆素1种成分。在此原料条件和提取情况下，ADS-21更适合大豆素的纯化。

　　2.2.2大豆素的薄层层析检测结果

　　标准品和样品扫描峰的完全一致性说明由大豆乳清水所制备样品与大豆素标准品是同一种物质。图3为大豆素标准曲线，其方程为Y=9647.440X-4164.758，相对标准偏差为2.17%。经检测和计算，由大豆乳清水制备大豆素产品20mg，纯度为98.5%，其纯度满足常规标准品要求。薄层层析扫描测定大豆素方法的精密度为1.67%，重复性为1.83%，稳定性为1.89，回收率为96.9%，以上结果表明了该检测方法的准确性、稳定性、灵敏性和可靠性。

　　3讨论

　　3.1大豆素的提取方法

　　大豆异黄酮各个成分之间具有相似的结构和性质[7，16-17]，从结构相近的类似物中分离高纯度的目的物一直是一个具有挑战性的难题，也是一项极其重要的高新技术[14]。实验发现，5%碳酸钠可使大豆乳清水沉淀分层，并明显降低上清液的染料木素含量，而大豆素含量降低较少。这应该与二者的结构有关，染料木素在5位多一个酚羟基，其酸性强于大豆素[7]，碱性的碳酸钠优先与染料木素反应。

　　大豆异黄酮苷溶于水[7，16-17]，苷在乙酸乙酯中的溶解度很小，乙酸乙酯不溶于水，所以用乙酸乙酯提取5%碳酸钠的分层液，大豆素、染料木素、黄豆黄素这些苷元易溶于乙酸乙酯，而苷仍留在碳酸钠溶液中。所以乙酸乙酯提取去除了大部分苷，提取得苷元。乙酸乙酯易于和水分离，分离出的乙酸乙酯只需薄膜蒸发器即可达到循环使用的纯度要求。整个大豆素制备工艺简单，生产周期短，投资少，不需苛刻的生产条件，易于实现大规模生产，为以大豆乳清水为原料工业化生产高纯度大豆素标准品、药物和保健品提供了技术基础。

　　3.2大豆素的纯化方法

　　之前的多项研究表明[2，16，18-19]，多种大孔树脂对大豆异黄酮的吸附洗脱均效果良好，表明大孔树脂纯化大豆异黄酮作为一项有效技术无可质疑。但是其上柱样品的原料来源、提取和分离工艺等均会造成样品中所含杂质的种类、多少不同。洗脱剂的多寡、种类和浓度，大孔树脂的种类、交联度、孔的大小、杂质的多少、前处理的效果、机械强度、极性和疏水性等均影响大豆异黄酮的吸附洗脱效果。大豆乳清水制备大豆素是新工艺，利用大孔树脂吸附洗脱该样品制备高纯度的大豆素存在诸多不确定因素，必须探讨此工艺的相关参数。通过查阅资料，我们选择了5种大孔树脂对大豆素进行分离纯化，ADS-21吸附洗脱效果最好，所制备的大豆素纯度达98%以上。

　　本研究只从大豆乳清水中提取了大豆素，实际上大豆乳清水中还有其他大豆异黄酮成分存在值待进一步研究。大豆乳清水为原料生产大豆异黄酮，简化了以豆粕为原料生产大豆异黄酮的工艺，是对大豆乳清水的有效利用。把大豆乳清水中的大豆异黄酮全部提取、分离、纯化出来作为食品、药品和标准品等，不仅可以丰富大豆产品加工厂的高附加值产品品种，助推蛋白生产企业的发展，同时易于废水的后续处理，能够改善动植物的生存环境。因此，大豆乳清水是生产大豆异黄酮优质且低价的原料，该研究能够实现经济、社会效益的双赢。

　　参考文献:

　　[1]孙艳梅，张永忠.水解制备大豆异黄酮甙元研究进展[J].食品研究与开发，2002，23(3):11-13.DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2002.03.004.

　　[2]蔡立，郁建平，占建波.豆粕中大豆异黄酮提取纯化工艺研究[J].食品科学，2008，29(4):185-188.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.04.036.

　　[3]鞠兴荣，袁建，汪海峰.大豆异黄酮提取工艺的优化[J].中国粮油学报，2001，16(6):17-19.DOI:10.3321/j.issn:1003-0174.2001.06.005.

　　[4]李南薇，唐晓恩，钟银链.大豆异黄酮提取和应用研究进展[J].广东农业科学，2010，37(5):118-120.DOI:10.3969/j.issn.1004-874X.2010.05.051.

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