鸟嘌呤四链体在生化分析中的应用进展

　　摘要鸟嘌呤四链体(G鄄四链体)是一种特殊的核酸二级结构，它可与高铁血红素结合，形成具有过氧化物酶活性的核酶;也可增强特殊结构染料的荧光强度。G鄄四链体作为功能核酸中的一种，具有性质稳定、特异性好、功能多样等特点，被广泛应用于各种生化分析中。本文对近年来G鄄四链体在生化分析中的研究和应用进展进行了评述，对其应用前景进行了展望。

　　关键词G鄄四链体;功能核酸;核酶;生化分析;评述

　　1引言

　　随着现代医学的发展，特定核酸、蛋白、酶等的检测，已成为某些疾病的直接或间接诊断指标[1~3]。而传统的检测方法，如高效液相色谱法、聚合酶链式反应(PCR)、免疫印迹法、电泳法[4~6]都涉及专业人员操作以及大型仪器的使用，存在检测时间长、操作复杂、检测灵敏度不高等问题。而比色法及荧光法[7，8]作为仪器分析中的经典方法，重复性好、操作简单，易于试剂盒的开发。比色法或荧光法中如何高效稳定输出信号的报告分子是分析方法的研究热点。功能核酸鸟嘌呤四链体(G鄄四链体)的特殊理化性质，如与高铁血红素结合生成具有过氧化物酶活性的核酶、增强特殊结构染料的荧光强度等，可灵活地实现信号的稳定输出。

　　利用G鄄四链体作为报告分子，与各种功能核酸或核酸信号放大方法联用，可实现多种目标分子高特异性、高灵敏的检测，为多种生化分析提供快速、简便的检测方法。本文首先介绍了G鄄四链体的分类和功能，以及利用其与金属离子作用引起的结构变化而导致性质的变化，结合特定染料或药物分子的性质，与其它功能核酸联用等，在小分子、蛋白质、酶、金属离子、目标DNA或RNA检测、细胞成像及癌症治疗等方面应用的研究进展进行了评述。

　　2G鄄四链体简介

　　2.1G鄄四链体的分类

　　鸟嘌呤平面是由4个鸟嘌呤通过氢键构成的方形平面，G鄄四链体由几个鸟嘌呤平面堆叠而成，其结构由处于平面之间的金属离子形成稳定金字塔结构[9]。中心稳定离子为一价或者二价金属离子，其中K+是最常见的金属离子，金属离子的大小决定G鄄四链体结构的稳定性[10，11]。根据形成G鄄四链体的DNA或RNA链的数目分类，由一条链形成四链体结构称为分子内G鄄四链体，多条链构成的称为分子间G鄄四链体。根据链的走向可分为3类:当四条链的方向均相同时，为平行结构;当两条链方向相同，另两条链与其方向相反时，为反平行结构;其它情况称为混合平行结构[12，13]。

　　G鄄四链体的结构可通过圆二色谱测定。所有的G鄄四链体结构在210nm处都有一个正的特征吸收峰。平行结构的G鄄四链体在240nm处有一个负吸收峰，在260nm附近有一个正吸收峰;反平行结构的G鄄四链体在260nm处有一个负吸收峰，在290nm处有一个正吸收峰[14]。G鄄四链体的结构主要取决于DNA或RNA的序列、核酸链的浓度和稳定离子的种类[15]。以稳定离子种类为例，Kong等[16]发现同样的序列在K+或Na+条件下形成不同的结构，他们系统研究了以T为间隔的碱基序列(5忆鄄G3TiG3TjG3TkG3鄄3忆)。当T的总数目臆5时，在100mmol/L的K+和Na+条件下均形成平行结构;当T的总数目为6~7时，在K+存在下依然形成平行结构G鄄四链体;而Na+稳定时折叠成混合平行结构。Li等[17]发现，PW17在K+存在下形成平行结构G鄄四链体，而Pb2+条件下为反平行结构。

　　2.2G鄄四链体的性质

　　2.2.1G鄄四链体构成的模拟酶

　　具有酶催化活性的DNA或RNA称为核酶(DNAzyme/RNAzyme)[18]。目前已发现具有切割或连接DNA/RNA、模拟过氧化物酶等活性的核酶[19~21]。G鄄四链体与辅因子高铁血红素(Hemin)结合形成具有过氧化物酶活性的核酶，可催化多种底物的氧化，包括ABTS、TMB、Am鄄plexRed、鲁米诺等。这种核酶是Travascio等[22]在筛选可特异结合N鄄甲基化卟啉IX的核酸适配体时发现的，而后进一步优化得到18个碱基的核酸适配体PS2.M。PS2.M形成的G鄄四链体与Hemin构成的核酶，其催化活性是Hemin单独存在时的250倍[23]。此类核酶的催化反应机理与辣根过氧化物酶类似，G鄄四链体模拟辣根过氧化物酶中的组氨酸残基为Hemin中的Fe提供一个轴向配体和一个疏水环境，有利于OO的异裂。

　　G鄄四链体为Hemin提供一个平面结构，有利于氢的交换[24~26]。目前，对于此类核酶的活性调控主要有3种方法:(1)是改变G鄄四链体本身的序列，从而改变其拓扑结构来影响其性质;(2)是改变稳定中心离子，从而改变G鄄四链体的构型而改变Hemin的结合情况;(3)是在G鄄四链体的序列末端增加腺嘌呤，可将其活性提高至原有活性的4倍[24]。另外，还可加入ATP来稳定催化过程中产生的自由基，提高催化效率[27]。

　　2.2.2G鄄四链体增强荧光的染料

　　G鄄四链体可结合一些特定的荧光染料，极大地增强染料自身的荧光强度，例如卟啉衍生物、酞菁染料、结晶紫、三苯甲烷等染料。荧光增强的原理是G鄄四链体可为染料分子提供一个疏水环境，防止荧光分子的相互靠近导致的自淬灭现象。结晶紫(Crystalviolet，CV)是一种三苯甲烷染料，堆积在两个鸟嘌呤平面之间，可区分平行和反平行G鄄四链体。反平行G鄄四链体的Loop环可结合CV使其不受溶剂的影响，使得荧光大大增强。而平行G鄄四链体侧链的Loop环不能结合CV，使得CV的荧光增强明显弱于结合反平行G鄄四链体的CV[16]。硫磺素T(ThioflavinT，ThT)是一种水溶性染料，可特异性地识别并结合G鄄四链体，结合后其荧光强度可增大2500倍[28]。

　　(Z)鄄4鄄(3，5鄄difluoro鄄4鄄hydroxybenzylidene)鄄1，2鄄dimethyl鄄1H鄄imidazol鄄5(4H)鄄one(DFHBI)是一种可与RNAG鄄四链体结合并对其进行特异性识别的染料分子，结合后可模拟绿色荧光蛋白的荧光，用于细胞中的RNA成像[29]。在此基础上，Feng等[30]报道了6种与红色荧光蛋白生色团类似的染料分子，与G鄄四链体结合后发出的荧光光谱范围几乎覆盖红色荧光蛋白的发射光谱，并且有较高的荧光量子产率，以此可模拟红色荧光蛋白，实现细胞内成像。

　　2.2.3G鄄四链体降低电信号的电化学活性分子

　　亚甲基蓝(Methyleneblue，MB)是一种带正电的芳香结构，是一种常用的电化学信号分子。Zhang等[31]研究发现，由于G平面的末端仔鄄仔堆叠效应，MB可竞争Hemin结合到G鄄四链体上，显著减少扩散到电极表面的MB，从而使得电流下降。

　　3G鄄四链体在生化分析中的应用

　　3.1小分子与蛋白质的检测

　　核酸适配体是经体外筛选，可高特异性和高亲和力地识别并结合目标分子的单链DNA或RNA。以G鄄四链体为信号分子检测小分子和蛋白质的传感分析方法大多与核酸适配体单元联用。如Willner研究组[32]将ATP的核酸适配体连接上一段G鄄四链体序列作为识别探针，另一条DNA与之部分杂交形成中间留有环状结构的双链结构。当ATP存在时，核酸适配体与ATP结合，识别探针从双链上解离下来，释放出的G鄄四链体与Hemin形成DNAzyme，催化底物反应。利用类似的设计，可实现可卡因、溶菌酶、细胞因子[33~35]等的检测。

　　在此类设计中，要求仔细筛选G鄄四链体和核酸适配体中被双链结构封闭的碱基数目，使得在有目标分子条件下G鄄四链体可从双链解离产生信号，而无目标分子时，G鄄四链体不会自动解离产生较高的背景信号。值得注意的，凝血酶有两种长度分别为15及29个碱基的核酸适配体，且都可形成G鄄四链体结构。Li等[36]利用凝血酶的核酸适配体结合凝血酶后，可促进核酸适配体形成的G鄄四链体，并更好地结合Hemin以提高DNAzyme的催化活性，从而实现凝血酶的检测。

　　3.2酶活性的分析

　　酶是生命过程中不可或缺的一部分，各种疾病的发生都与酶活性的异常相关，因此酶活性的检测是生化分析中的重要内容。以G鄄四链体为信号分子分析酶活性的报道中，检测对象大多是以核酸为底物的酶。以下介绍几种在疾病诊断、分子生物学中有重要意义的酶的检测方法。

　　3.2.1T4多聚核苷酸激酶(T4poly鄄nucleotidekinase，T4PNK)T4PNK是一种双功能酶，可移除3忆磷酸基团以恢复3忆羟基基团，也可实现5忆磷酸化。Liu等[37]报道了一种基于G鄄四链体鄄DNAyzme比色检测T4PNK的方法。在该体系中，设计了两条探针，一条是3忆磷酸化的引物，一条是封闭有G鄄四链体序列的发夹探针。

　　当T4PNK存在时，引物的3忆磷酸被去磷酸化，生成3忆羟基，此时聚合酶可将引物延伸打开发夹，释放G鄄四链体序列。该方法可检测低至0.01U/mL的T4PNK。基于T4PNK5忆磷酸化活性，裴仁军研究组[38]设计了一种裂分的G鄄四链体DNAzyme检测体系，实现最低浓度0.014U/mL的T4PNK的检测。

　　3.2.2核酸外切酶芋(Exonuclease芋，Exo芋)Exo芋具有从3忆鄄5忆方向切割DNA的活性，在DNA复制等生理过程中有重要意义。Leung等[39]设计了发夹茎部含有G鄄四链体结构的探针用于分析Exo芋的活性。核酸内切酶芋从发夹茎部的3忆端切断，最后剩下的单链部分即为G鄄四链体，与CV结合后大大增加其荧光，以此来检测核酸内切酶芋的活性。

　　3.2.3DNA连接酶(DNAligase)DNA连接酶能催化DNA分子内或分子间毗邻的5忆磷酸基团和3忆羟基基团形成磷酸二酯键，将两段相邻的DNA拼合成一条完整的DNA链。He等[40]利用DNA连接前后对于发夹结构的改变，开发了基于G鄄四链体检测DNA连接酶的方法，最低可检测0.2U/mL的DNA连接酶。

　　3.3金属离子的检测目前，金属离子污染问题日趋严重，开发高效检测金属离子的方法，成为研究者关注的热点。以G鄄四链体为信号分子的检测方法可简单、高效、便捷地检测金属离子，按其检测原理可分为三类。

　　3.3.1特异性稳定G鄄四链体的金属离子利用中心离子稳定的G鄄四链体构型不同而实现检测。Li等[17]报道了一种基于G鄄四链体结构变化检测Pb2+的方法。PS2.M在K+存在时折叠成平行结构的G鄄四链体，与Hemin结合后显示较高的过氧化物酶活性。在Pb2+存在时，PS2.M折叠成反平行的G鄄四链体，不利于与Hemin的结合，过氧化物酶活性下降。根据K+与Pb2+稳定的G鄄四链体的催化活性的差异，可实现二者的检测(图4A)。利用此原理，还可实现Tb3+[51]、Ba2+[52]等的检测。此外，还有一类特殊的例子，如利用Cu+能高效催化叠氮基团与炔基的Click反应，使得两条裂分的DNA连接后能形成G鄄四链体结构，加入取代链后可将完整的G鄄四链体序列置换下来，实现CV的荧光增强，对Cu2+进行检测，最低检测浓度可达到65nmol/L[53]。

　　3.3.2与碱基作用的特定金属离子利用特定金属离子与碱基的作用实现金属离子检测，如T鄄Hg2+鄄T，C鄄Ag+鄄C结构的形成。其中一类是基于金属离子与碱基作用后抑制G鄄四链体的形成(Turn鄄off模式)，另一类是促进G鄄四链体的形成(Turn鄄on模式)。Willner研究组报道了一种基于T鄄Hg2+鄄T的分子机器检测Hg2+。Li等[55]报道了基于C鄄Ag+鄄C作用下，拉近两条裂分的G鄄四链体序列，构成完整G鄄四链体检测Ag+，检出限为2.5nmol/L。

　　4总结与展望

　　G鄄四链体作为一种功能核酸，具有性质稳定、特异性好、功能多样等特点，被广泛用于各种生化分析中。目前基于G鄄四链体开发的分析检测方法包括比色法、荧光法、电化学、电化学发光等多种形式。由于G鄄四链体结构的特殊性，其被用于细胞成像以及癌症治疗等方面的研究。G鄄四链体未来主要的发展趋势可能有以下方面:(1)提高模拟过氧化物酶的活性。目前的研究结果表明G鄄四链体构成的核酶虽然可通过前文方法提高活性，但是对比蛋白酶的活性还是有很大差距。因此，提高核酶活性是重要的研究内容。(2)特异性识别的红外染料的合成。随着成像技术的发展，普通荧光成像面临着高背景、易被光漂白等应用方面的限制。开发组织穿透能力高，结合G鄄四链体后能显著增强荧光的染料，可拓展G鄄四链体在细胞成像方面的应用。(3)便携式传感器的开发与应用。目前，基于G鄄四链体的分析传感方法多局限于实验室应用，开发便携式(如试纸类、数显类)直读型便携式商用传感器将是未来的研究趋势。

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