藻类中添加剂的应用研究进展

　　摘要：藻类富含多种营养元素和活性物质，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。现阶段藻类培养多采用露天跑道池，成本低，但易受环境影响。不适宜的环境条件(温度、酸性、重金属、紫外、盐度和光强胁迫等)会造成藻类生产成本上升、产品产量及品质下降等后果，严重制约藻类养殖业及相关产业的发展。

　　添加剂不仅能有效促进藻类生长，还能缓解环境胁迫对其带来的逆境伤害。将近年来添加剂在藻类生长及抗逆方面的应用进行系统汇总，并对已阐明的几种添加剂的作用机理进行分析整理。添加剂在藻类中的应用研究大多停留在生长及生理指标的测定，如藻细胞密度、光系统活性、渗透调节物质含量、脂质含量、过氧化氢酶和硝酸还原酶活力等，仅有少部分研究是利用分子技术测定防御基因的表达情况，尝试进一步探究藻类抗逆性分子机制。旨在为研究者进一步明确常用添加剂在藻类中的信号传导机制及改善非生物胁迫造成的产品产量及品质的问题提供理论依据，具有重要现实意义。

　　关键词：藻类;添加剂;作用机制;生长;抗逆性

　　藻类富含蛋白质、多不饱和脂肪酸及维生素等，营养价值可观。一些大藻(如紫菜)可作为即食食物被开发利用。微藻不仅营养丰富，还兼具易消化、易摄食的特点，是水产养殖中的优质活体饵料[1]。藻类还含有多种活性物质，具有巨大的开发潜力。例如，雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)中的虾青素，具有着色、抗氧化和增强免疫力等作用，可有效提高水产动物的存活率和水产品的运输及保藏效果等[2-3]。螺旋藻(Spirulinasp.)中的γ-亚麻酸、螺旋藻多糖和藻蓝蛋白等被制备成药物，具有提高人体免疫力、消炎等功效[4]。此外，藻类作为食物链的第一级生产者，其光合作用和呼吸作用可调节水体pH平衡，间接影响水质、水体透光度、藻菌关系等[1，5]。另有研究表明，藻类对生物毒性极其敏感，可用于监测水质[6]。

　　现阶段藻类培养主要有封闭式和开放式两种方式。封闭式的光生物反应器培养过程可控，不易污染，但成本较高，进一步扩大养殖规模较难。开放式跑道池虽然易受环境影响，但其成本较低，故被广泛应用。随着市场需求的增大，藻类品质和产量都需要得到提升，而跑道池养殖中面临的温度胁迫、紫外线胁迫、重金属污染及盐度胁迫等问题都严重制约着藻类规模化养殖业的发展。因此，研究藻类的抗逆性以改善因非生物胁迫造成的藻类减产、损害及种质退化等问题，从而提高藻类的养殖成效是实现藻类规模化高密度养殖来获取更高经济效益的关键。

　　1常用添加剂及其作用机制

　　近年来，研究者们通过使用添加剂以促进陆生植物生长及提高其抗逆性，已取得一定成效。现阶段，研究者们也尝试将这些添加剂运用到在藻类研究及生产中。尝试使用一种或多种添加剂，以期提高藻类生物量，降低非生物胁迫给藻类造成的损伤，提高藻类抗逆性，以获得更多的生物量及活性物质。下面就一些常用外源添加剂在陆生植物及藻类中的运输方式、代谢途径及作用机制进行总结。

　　1.1水杨酸及其作用机制

　　水杨酸(Salicylicacid，SA)，即邻羟基苯甲酸，是植物体内一种简单酚类物质。SA能影响植物体和藻体内蛋白质和光合色素的积累，以提高其生长速率、调节其生长发育[7]。非生物胁迫易造成植物体内活性氧含量失衡及氧化胁迫。外源SA通过与SA受体(如NPR1)结合，激活免疫系统，或改善植物体内抗氧化酶活性，甚至进入细胞内直接或间接诱导防御基因的表达，生成抗氧化化合物(如花青素)，从而提高植物的抗逆性[8-9]。

　　SA提高非生物胁迫下藻类抗逆性的机制与陆生植物类似。SA通过与藻体内的信号物质(如NAC蛋白、MYB蛋白)结合，调控藻体内的抗氧化活性物质基因的表达，以生成抗氧化活性物质;还可调节藻体内的各种酶(过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶和超氧化物歧化酶等)活力、渗透调节物质(可溶性糖、可溶性蛋白)含量，抵御非生物胁迫条件下产生的过量活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)[7，10]。

　　1.2油菜素内酯类及其作用机制

　　油菜素内酯类化合物(Brassinosteroids，BRs)在植物和藻类的生长、发育、繁殖过程中起着重要作用，包括24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide，24-EpiBL、EBR)、24-表油菜素甾酮(24-epicastasterone，24-epiCS)、高油菜素内酯(Homobrassinolide，homoBL)等。外源BRs通过调控植物细胞内激素水平，激活抗氧化酶保护系统，降低相对电导率，控制叶绿素含量，促进光合产物运输、一氧化氮积累和多个胁迫相关基因(RD29A、ERD10、RD22)的表达，最终提高陆生植物的抗逆性[11-12]。在藻类方面，BRs通过调控藻细胞体内激素水平，激活抗氧化酶保护系统，产生非酶抗氧化剂(抗坏血酸、谷胱甘肽等)，促进细胞分裂，缓解胁迫带来的损伤，甚至可恢复到原来的水平[13]。可见，BRs在陆生植物和藻类的作用机制很相似。

　　1.3脱落酸及其作用机制

　　脱落酸(Abscisicacid，ABA)是植物体内普遍存在的一种激素，是参与植物信号传导的最为重要的一种信号分子。添加外源ABA可促进内源ABA的生成，使ABA受体接收和传递逆境信号，诱导ABA响应元件结合蛋白(AREB1、AREB2和AREB3等)表达，高度磷酸化后激活下游相关基因的表达，同时降低细胞膜透性，调控气孔开闭，增加抗氧化酶活性，抑制ROS的积累，从而提高植物的抗逆性[14-16]。

　　ABA在藻类中也有发现。利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)的方法，苗钧魁等[17]第一次在海带中分离纯化出高活性的ABA。研究发现，在藻类中，外源ABA不直接增加藻的光合活性，而是通过保护光系统免受ROS的破坏，促进藻体清除ROS，或者促进脂质的积累，从而提高藻类的抗逆性植物[18-19]。

　　1.4赤霉素及其作用机制

　　赤霉素(Gibberellinacid，GA)作为一类内源性激素在藻类的生长发育中发挥着重要的作用[20]。Reinecke等[21]表明，在已发现的136种天然赤霉素中，仅有GA1、GA3、GA4、GA7四种具有生理活性[22]。外源GA诱导降低GA合成代谢关键酶(GA3-oxidase和GA20-oxidase)和受体蛋白基因的表达，减少内源GA含量，或抑制信号传导途径中DELLA蛋白(因其N端含有D、E、L、L和A这5种氨基酸的DELLA结构域而命名)积累，提高活性氧解毒酶基因表达，降低活性氧水平，以提高植物的抗逆性[23-24]。也有研究发现，GA可与藻体内抗氧化活性物质的基因顺式作用原件结合，调控相应基因表达，消除过多的ROS，还可通过增加光合色素、可溶性蛋白的积累，以提高藻体抗逆性[25-26]。但总体看，GA在藻体中调控机制的研究还不够完善，有待进一步挖掘。

　　1.5钙及其作用机制

　　钙(Ca2+)是植物生长必需的营养元素，且作为偶联胞外信号与胞内生理生化反应的第二信使，参与调控植物的代谢和发育[27]。当植物受到非生物胁迫时，外源Ca2+与钙调蛋白结合，传递信号，激活Ca2+通道，维持细胞内离子(K+、Na+、Mg2+等)的平衡以保护膜的完整性，并激活特定的保护酶系统。

　　也可通过Ca2+依赖蛋白激酶识别特定Ca2+浓度信号，受体靶蛋白被激活，诱导抗性基因的表达，最终提高植物抗逆性[28-30]。外源Ca2+激活藻细胞内膜的Ca2+通道，维持细胞内外离子(Ca2+/Na+)的平衡，降低膜透性，刺激钙调素基因的表达，促使生成钙调蛋白并与之结合，传递信号。当受到胁迫时，Ca2+诱导合成中性脂质，激活抗氧化酶系统，以缓解胁迫带来的损伤[31-32]。

　　1.6生长素及其作用机制

　　生长素(Auxin，AUX)是一类含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素，在植物的生长发育过程中起重要调节作用。天然AUX主要包括3种，即吲哚-3-乙酸(Indole-3-aceticacid，IAA)、吲哚丁酸(Indolebutyricacid，IBA)和萘乙酸(Naphthylaceticacid，NAA)。此外，如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D)等是AUX类似物，也具有广阔的应用前景。Gupta等[33]首次在藻类中发现了IAA和IBA同时存在。

　　在陆生植物遭受非生物胁迫时，外源AUX或AUX类似物，与细胞中AUX受体结合，启动质子泵(H+-ATPase)形成电化学梯度，酸化细胞壁，诱导防御基因表达，并调控保护酶系统和积累保护物质(脯氨酸或谷胱甘肽)，或直接与气孔保卫细胞通道外表面结合，调节光合作用效率，最终提高植物的抗逆性[34]。

　　Sakata等[35]还发现，外源AUX可恢复DNA复制许可因子(MCM5)的表达，逆转高温胁迫引起的植物雄性植株的不育。在藻类中，AUX可调控内源性植物激素的代谢平衡，促进藻细胞内色素、脂质积累，调控硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、叶绿素荧光等活性，缓解胁迫条件对藻的损伤[36-37]。

　　1.7茉莉酸类及其作用机制

　　茉莉酸类(Jasmonates，JAs)物质，是一种新型内源植物生长调节物质，其中典型代表有茉莉酸甲酯(Methylejasmonate，MeJA)和茉莉酸(Jasmonicacid，JA)。JAs在陆生植物和藻类中的作用类似，不仅参与生长调节，还诱导抗逆信号的产生及防御基因的表达。外源JAs通过调节保护性酶(过氧化物酶、过氧化氢酶等)的活性，促进次生代谢产物(如藻黄素、虾青素)相关基因的表达、渗透调节物质(如脯氨酸、可溶性蛋白)的积累，或通过影响启动子的活性、促进防御蛋白及次生活性物质的合成来提高植物和藻体的抗逆能力[38-43]。

　　1.8细胞分裂素及其作用机制

　　细胞分裂素(Cytokinin，CTK)是腺嘌呤的衍生物，包括玉米素(Zeatin，ZT)、激动素(Kinetin，KT)和6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA、BA、BAP)等。外源CTK与受体(AHKs)结合，磷酸化后进入细胞，激活防御基因的表达[44]。CTK还可直接或间接清除氧自由基，减少脂质的过氧化程度，改变膜脂中脂肪酸比例，提高光合速率、气孔导度和蒸腾速率，最终提高植物的抗逆性[45-46]。在藻类中，外源CTK则是通过促进藻细胞分裂增殖，促进不饱和脂肪酸的积累，刺激抗氧化系统，提高光合作用效率和氮代谢循环来促进藻生长和提高藻的抗逆性[37，47]。

　　2添加剂在藻类生长及抗逆方面的应用

　　2.1生长方面的应用

　　研究者们尝试通过使用添加剂来获取更多的藻类生物量或活性物质，以取得更大的经济效益。研究发现，ABA(1.0mg/L)、SA(10mg/L)和JA(0.5mg/L)可使小球藻(ChlorellavulgarisZFstrain)的脂质生产率分别提高123%、100%和127%[48]。据报道，三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中三酰甘油(TAG)合成基因上游存在植物激素的响应性顺式调节元件，外源植物激素(SA、ABA和MeJA等)可与该元件结合，进一步提高三角褐指藻的油脂含量[49]。

　　Park等[50]研究发现，IAA、ABA和GA3可促进细胞分裂，增加蛋白质积累，最终促进莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)生长;ABA还可大幅提高其淀粉含量(从2.2%增加至6%)，而IAA和GA3对淀粉含量无影响。低浓度的ABA能促进紫球藻(Porphyridiumsp.)生物量(达3.463g/L)、胞外多糖(达干重34.31%)和藻红素等积累，但当ABA浓度超过10mg/L则呈抑制趋势[51]。研究者尝试采用多种添加剂组合的方式，以期达到更好的促进效果。

　　史成颖等[52]分别探究6种植物激素(NAA、2，4-D、IBA、IAA、6-BA和GA)对钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)生长的影响，找到最适浓度之后，选择效果最佳的4种(NAA、2，4-D、6-BA和GA)进行交叉组合，只有NAA与6-BA的组合促进藻的生长。而Bajguz和Piotrowska-Niczyporuk等[53]研究则表明IAA与BRs的组合能显著促进小球藻(C.vulgaris)的细胞增殖，且比单一作用显著，细胞数比对照组增加了321%。因此，可根据实际需求及藻种的不同，挑选适宜的一种或多种添加剂，施以适宜的浓度，以达到最佳的培养效果和最低的生产成本。

　　2.2低温胁迫

　　适宜的温度是保证藻类正常生长的重要环境因子之一。温度过高或过低都会影响藻的生理生化特性及代谢过程，进而影响其生长，即高温胁迫和低温胁迫。研究表明，低温胁迫可导致球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)细胞内活性氧过量积累，进而造成膜脂过氧化[54]。温度越低，膜脂损伤程度越大。低温胁迫还会造成藻体净光合速率、叶绿素a(Chla)及藻蓝蛋白含量下降[55]。大量陆生植物的相关研究显示，添加剂可以提高植物的低温抗逆性[56-58]。

　　类似的尝试在藻类中较少。陈文笔等[59]报道，添加15mg/L的SA对低温胁迫下提高微拟球藻(Nannochloropsissp.)低温抗逆性效果最显著，96h时藻密度、可溶性糖和可溶性蛋白分别比对照组提高了21.97%、29.17%和27.40%，且不饱和脂肪酸含量也比对照组提高了6.27%;此时Δ5和Δ6去饱和酶基因转录水平为对照组的8.63、6.14倍。基于以上实验结果，后续可进行更多尝试，以期解决低温环境下藻类培养的难题。

　　2.3高温胁迫

　　短时间的高温胁迫下，藻体可启动自身防御系统，增加光系统II和I的光子捕获能力和电子传递速率以降低损伤，还通过促进mRNA的生成、抑制tRNA的水解，增加拟核蛋白合成来保护和维持DNA的正常遗传信息传递过程[60]。若持续高温超过藻体承受范围，藻体内生成的活性氧无法有效清除，膜结构受到严重损伤，Chla含量显著降低，藻体则表现为生长减缓[61]。

　　研究发现，高温胁迫下，蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)生长受到抑制，新陈代谢活性降低，生长速率变缓;但添加10mg/LSA之后，热激蛋白70和磷酸甘油酸激酶的表达量明显上升，SA作用12h后可分别增加2.57和1.56倍，48h时生长速率、可溶性糖、可溶性蛋白分别达到对照组的2.07、1.34和1.18倍，生长抑制明显得到缓解[62]。

　　探讨高温胁迫下龙须菜(Gracilarialemaneiformi)抗逆性的结果显示，添加外源SA和EBR都可以提高龙须菜的高温抗逆性[63-64]。贺亮等[65]研究显示，高温造成半叶马尾藻中国变种(Sargassumhemiphyllumvar.chinense)抗氧化防御系统的损伤，添加Ca2+可得到有效的缓解;且藻体中渗透调节物质含量也明显增加，从而降低高温胁迫对细胞膜的伤害。基于这些研究，可以进行更多尝试，以期解决高温天气藻类培养困难、种质降低等问题。

　　2.4酸性胁迫

　　近年来，化石类燃料的大量使用、酸性气体(CO2、SO2和NOx)的无节制排放和森林的过度砍伐等，引起水体pH下降，给藻类养殖造成了酸性胁迫，影响了藻类生物量积累。张倩[66]发现，培养基pH降低之后，4株小球藻(2株蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)、1株普通小球藻(C.vulgaris)和1株海水小球藻(C.pacifica))的生长速率明显降低，当pH急剧下降为3.0时，降幅分别为91.52%、90.00%、88.03%和91.39%。

　　史飞飞等[67]将燃烧产生的气体通入培养液，培养液的pH急剧下降，导致斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)生长受到抑制，添加0-20mg/LGA后，斜生栅藻的生长得到恢复，且培养液pH恢复至正常值。其中，添加10mg/LGA效果最好，可使促进斜生栅藻的干重达到0.45g/L。添加剂在藻类抗酸性胁迫中应用较少，后续研究中可进行更多尝试，以期为利用酸性水质培养藻类生产更多高附加值产品提供更多的技术指导和理论支持。

　　3展望

　　外源添加剂可通过多种方式缓解非生物胁迫给藻体带来的伤害，在藻类生长发育和抗逆调节中起重要作用。但目前，添加剂在藻类中的应用研究，尚停留在生长及生理指标的测定等，仅有少部分研究利用分子技术测定防御基因的表达情况，尝试进一步探究藻类抗逆性分子机制。添加剂在藻类中完整的信号传导途径及作用机制尚不清楚[20，47]。

　　目前，藻类的抗逆性研究多侧重于高温和重金属胁迫，而其他非生物胁迫研究的深度和广度都较低。由大量陆生植物抗逆性研究可预知，添加剂在提高藻类的抗逆性方面可能具有广阔前景。外源添加剂对不同藻类抗逆应用的施用浓度、时间及方式等还不明确，且其作为信号分子，是直接参与信号传递还是诱导内源物质生成进行信号转导，又有哪些基因表达得以促进或被抑制，还有待于深入研究。

　　另外，许多藻类研究尚停留在实验阶段，还未进入实际生产中。而实际生产中，藻类培养面临的往往不是单一非生物胁迫挑战，故开展多组胁迫综合分析十分必要。系统化的研究手段已呈多元化发展，因此可根据实际情况开展多组分析研究，寻求更佳的解决方案。随着添加剂与非生物胁迫相关信号通路和基因诱导表达调控研究的深入，利用分子育种手段有望实现藻类选择性育种，从而为藻类的实际生产应用提供更有效的理论依据和技术指导。

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