酶法修饰对乳蛋白功能性质的影响

　　摘要：该试验研究了酶法修饰对乳蛋白功能性质的影响。乳清蛋白的单酶和双酶修饰产物的乳化活性并没有显著的升高或降低，但乳化稳定性相比于原料乳清蛋白分别下降了18.1%和28.55%。脱脂乳粉的2种酶修饰产物的乳化活性及乳化稳定性都与原料脱脂乳粉基本保持同一水平，无明显差异。模拟体外消化过程检测结果显示，与原料乳清蛋白相比，经酶法修饰后的乳清蛋白产物一步消化和两步消化后释放的肽量均有所增加，并且单酶修饰乳清蛋白比双酶修饰乳清蛋白的消化性更好。

　　疏水性检测结果显示，单酶体系和双酶体系修饰的乳清蛋白和脱脂乳粉的表面疏水性都明显高于相应的原料蛋白，其中，单酶体系修饰的乳清蛋白表面疏水性要比双酶修饰乳清蛋白略高，而双酶体系修饰脱脂乳粉高于单酶体系修饰脱脂乳粉，结果与固有荧光性分析的结果一致。该研究目的是确认单酶及双氧化酶体系修饰乳蛋白的可行性，阐明其对乳蛋白功能性质的影响，为乳蛋白功能性质的改善提供一种新途径，对拓宽乳蛋白在食品加工产业中的应用具有实际的理论指导意义和应用价值。

　　关键词：乳清蛋白;脱脂乳粉;双氧化酶体系;功能性质

　　牛乳蛋白是一种营养丰富的优质动物性蛋白，占牛乳的3.3%～3.5%，含有大部分必需氨基酸，易于消化和吸收[1]。其中，乳清蛋白作为一种重要的食品蛋白质而被广泛应用于食品工业，尤其是作为食品基料而添加到婴儿配方乳粉中。本研究以乳清蛋白和脱脂乳粉为原料，分别采用葡萄糖氧化酶单酶体系和葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶结合的双酶体系处理原料蛋白，并分析该反应对修饰产物结构、功能性质的影响，旨在为乳清蛋白的酶法改性提供有效途径和技术支持。对于蛋白质改性的相关研究是当前乳制品加工技术研究中的一个热点。蛋白质改性，就是用物理或生化手段，使其氨基酸残基和多肽链发生变化，改变其功能特性，以此制备具有更优质功能特性的蛋白质。物理方法和化学方法存在反应特异性低、反应条件严格、难以控制蛋白变性程度等不足。

　　而酶促反应有着反应条件温和、副反应少、专一性强的特点，因而酶法修饰蛋白得到了广泛关注与发展。Nivala等[2]分别用转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶交联燕麦和蚕豆蛋白，改善了胶体稳定性和发泡性能。黎芳等[3]通过添加葡萄糖氧化酶改善了面团的网络结构，使面团的韧性得到增强。此外，转谷氨酰胺酶改性乳蛋白浓缩物并用于酸乳中，增加了酸乳的感官黏度和凝胶强度，使酸乳品质得到提升[4]。近年来，利用转谷氨酰胺酶交联蛋白质已被广泛研究，而利用氧化还原酶，如：葡萄糖氧化酶、漆酶、辣根过氧化物酶来改性蛋白的研究还比较少。

　　葡萄糖氧化酶作为需氧脱氢酶[5]，是一种安全性很高的氧化还原酶，因此可以被应用于食品、药品等领域中。将葡萄糖氧化酶应用于改善馒头品质的研究表明，馒头的比容增加，延展性增加，硬度下降，品质得到改良[6]。辣根过氧化物酶催化的反应中，包括芳香族化合物、酚类化合物等在内的还原性底物，与过氧化氢反应，生成了相对应的自由基。辣根过氧化物酶比活性高、稳定性好，应用于食品工业前景广阔[7]。

　　已有研究表明，牛乳经辣根过氧化物酶和阿魏酸处理之后，制备的酸乳的质构和流变学特征得到改善[8]。以此为依据，本研究以乳清蛋白和脱脂乳粉为原料，分别采用单酶体系(葡萄糖氧化酶与葡萄糖)和双酶体系(辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶与葡萄糖)修饰乳蛋白，分别采用一步法与两步法对双酶修饰产物的体外消化性进行检测，并以原料乳蛋白和单酶修饰乳蛋白作为对照，对修饰产物的表面疏水性、乳化性能进行评价，研究酶法修饰对乳蛋白功能性质的影响。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶：美国Sigma公司;乳清蛋白、脱脂乳粉：北京泛亚乳品公司;其他试剂均为国产分析纯。UV-2401PC紫外可见分光光度计：日本岛津公司;F4500荧光分光光度计：日立高新技术公司。

　　1.2实验方法

　　1.2.1酶修饰乳清蛋白样品的制备

　　氧化体系包括葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶双酶体系和葡萄糖氧化酶单酶体系。乳清蛋白溶液的浓度为5%(w/v)，葡萄糖氧化酶的添加量为2U/g蛋白质，辣根过氧化物酶添加量为200U/g蛋白质，葡萄糖添加量为0.015mmol/g蛋白质，在37℃恒温摇床中反应4h。反应结束后，修饰产物灭酶后冷却冻干备用。同时制备单酶修饰乳清蛋白样品，除不添加辣根过氧化物酶外，其余条件与双酶修饰反应条件相同，样品反应结束后同样冻干备用。

　　1.2.2酶修饰脱脂乳粉样品的制备

　　氧化体系包括葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶双酶体系和葡萄糖氧化酶单酶体系。脱脂乳粉溶液的浓度为5%(w/v)，葡萄糖氧化酶的添加量为2U/g蛋白质，辣根过氧化物酶添加量为200U/g蛋白质，葡萄糖添加量为0.015mmol/g蛋白质，在37℃恒温摇床中反应4h。反应结束后，修饰产物灭酶后冷却冻干备用。同时制备单酶修饰脱脂乳粉样品，除不添加辣根过氧化物酶外，其余条件与双酶修饰反应条件相同，样品反应结束后同样冻干备用。

　　1.2.3酶修饰产物体外消化性分析

　　修饰产物体外消化性的检测分为一步水解法和二步水解法，实验参照Marciniak-Darmochwal等[9]以及Tang等[10]的方法。一步水解法即胃蛋白酶水解，将样品溶解成浓度为10g/L的样品分散液，取10mL调节pH至2.0，加入2mg胃蛋白酶，于37℃恒温水解2h。反应结束后，冷却至室温，加入等体积的浓度为200g/L的三氯乙酸溶液终止反应，10000×g离心20min，收集上清液，利用紫外分光光度计测定该稀释液在280nm下的吸光值。二步水解法即胃蛋白酶-胰蛋白酶水解，将样品溶解成浓度为10g/L的样品分散液，取10mL调节pH至2.0，加入2mg胃蛋白酶，于37℃水解2h。反应结束后，置于90℃水浴中灭酶5min，冷却后在电热板上蒸干。将蒸干后的物质重新溶解于10mL浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)中，加入6mg胰蛋白酶，于37℃水解1h。反应结束后，冷却至室温，其余同一步水解法处理。

　　1.2.4酶修饰产物疏水性分析

　　1.2.4.1固有荧光发射光谱扫描

　　通过检测蛋白样品固有荧光发射光谱，可以分析其特征，进而发现修饰反应引起的蛋白结构上的变化。用pH为7.0的50mmol/L磷酸盐缓冲溶液溶解蛋白样品，蛋白液终浓度为5mg/mL。激发波长280nm，激发波和发射波的狭缝宽度均固定为5nm，扫描速度240nm/min，发射光谱收集范围290～420nm。

　　1.2.4.2表面疏水性的测定

　　表面疏水性的测定方法参照Yu等[11]的外源荧光探针ANS的方法。准确称取冻干蛋白样品，用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液溶解，得到0.5mg/mL的蛋白溶液，经同样的缓冲溶液稀释得到一系列浓度(0.08～0.5mg/mL)的蛋白样品溶液。样品溶液离心(4℃)10000×g15min，取4mL上清液与20μL荧光探针ANS(8mmol/L溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液中，pH7.0)混合均匀，避光反应15min后，在激发波长390nm、发射波长470nm以及狭缝5nm的条件下，测定ANS结合物的相对荧光强度，然后以相对荧光强度为纵坐标、蛋白浓度为横坐标，以线性关系良好的回归曲线的斜率表示表面疏水性。

　　1.2.5酶修饰产物乳化性分析

　　蛋白质乳化性能的检测分为乳化活性及乳化稳定性，方法参照AgyareKK[12]的方法。用pH为7.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液溶解待测样品，配制成0.1%的蛋白样品溶液。将蛋白质溶液与一级精炼大豆油按体积比3:1混合，在12000r/min条件下均质1min。以1g/LSDS溶液调整仪器零点，分别在0min和静止10min时从容器底部同一位置取50μL乳液置于试管中，加入5mL浓度为1g/L的SDS溶液混匀，迅速于500nm处测定吸光度值。重复测定3次。乳化活性指数(EAI)及乳化稳定性指数(ESI)为：EAI(m2/g)=2×2.303×A0×稀释倍数/[C×(1—φ)×104]ESI(%)=A10×100/A0式中：A0为零时刻的吸光度值;C为蛋白样品浓度，g/mL;Φ为油相体积分数(0.25);A10为静置10min后的吸光度值。

　　2结果与分析

　　2.1酶修饰产物的体外消化性分析

　　本研究利用体外消化的方法，分别采用一步水解法(胃蛋白酶水解)和二步水解法(胃蛋白酶-胰蛋白酶水解)，模拟胃肠道环境，来研究酶修饰产物在人体内消化吸收及利用情况。通过测量蛋白质水解物上清液在280nm处吸光度值，可以反映出蛋白质经酶水解后的肽链释放量，以此来分析酶修饰产物在胃肠道内的消化利用情况，与原料乳清蛋白相比，经酶法修饰后的乳清蛋白产物一步水解和两步水解后释放的肽量均有所增加，并且单酶修饰乳清蛋白比双酶修饰乳清蛋白的消化性更好。经一步水解后，原料脱脂乳粉和经酶法修饰的脱脂乳粉产物释放的肽量没有明显的变化，但两步水解修饰产物中的肽量明显增多，且两步水解后单酶修饰产物的消化性高于原料脱脂乳粉和双酶修饰产物，这与乳清蛋白修饰产物的消化结果一致。

　　2.2酶修饰产物的疏水性分析

　　2.2.1固有荧光性

　　蛋白质内部的发色氨基酸的荧光参数可提供蛋白质结构变化的信息。蛋白质的固有荧光性由酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸决定，主要取决于色氨酸。在蛋白质的所有氨基酸残基中，色氨酸含有吲哚发色团，具有最高的辐射率和荧光产量，因此对其所在的蛋白质内部环境具有很高的敏感性。通常，当色氨酸所处环境由疏水性变为极性会导致发射荧光强度下降[13]。因此，通过监测色氨酸的荧光参数可准确地提供其邻近区域蛋白质结构变化的信息。表示经过单酶体系和双酶体系修饰的乳清蛋白和脱脂乳粉的荧光发射光谱。

　　经过单酶体系和双酶体系修饰的乳清蛋白的修饰产物的相对荧光强度明显高于原料乳清蛋白，说明酶法修饰乳清蛋白使蛋白质的疏水基团暴露，导致蛋白质固有荧光性增加。其中，单酶体系修饰的产物相对荧光强度要比双酶修饰略高。分析图2B可以发现，经过酶法修饰的脱脂乳粉的相对荧光强度较原料脱脂乳粉有明显的增强，说明酶法修饰同样影响脱脂乳粉的蛋白结构，但是，单酶体系修饰的脱脂乳粉的相对荧光强度低于双酶修饰产物，与乳清蛋白酶法修饰产物不同。

　　2.2.2表面疏水性

　　表面疏水性的测定采用荧光探针ANS的方法。外源荧光物质8-苯氨基-1-奈酚-磺酸(ANS)是一种对极性敏感的疏水性染料探针，优先与蛋白表面暴露的疏水性氨基酸结合，使得疏水位点的荧光强度显著增加，通过外源发色团可以定量描述蛋白质的表面疏水程度，反映蛋白质结构的变化。测定结果如图3所示。由图3中可以明显看出，单酶体系和双酶体系修饰的乳清蛋白和脱脂乳粉的表面疏水性明显高于相应的原料蛋白，说明酶法修饰使蛋白质的疏水基团暴露，显著增加乳蛋白的表面疏水性。其中，单酶体系修饰的乳清蛋白表面疏水性要比双酶修饰乳清蛋白略高。单酶体系和双酶体系修饰的脱脂乳粉的表面疏水性较原料脱脂乳粉有明显的增强，且双酶体系修饰产物高于单酶体系修饰产物，这里得到的结果与固有荧光性分析的结果一致。

　　2.3酶修饰产物的乳化性分析

　　对原料乳清蛋白及脱脂乳粉、单酶和双酶修饰乳清蛋白及脱脂乳粉的修饰产物的乳化活性和乳化稳定性进行检测，浓度为0.1%(w/v)的乳清蛋白、乳清蛋白单酶修饰产物、乳清蛋白双酶修饰产物的乳化活性分别为24.59、22.76、26.02m2/g蛋白质，乳化稳定性分别为51.50%、33.42%、22.95%。

　　数据结果表明，相比于原料乳清蛋白，单酶和双酶修饰的乳清蛋白修饰产物的乳化活性没有明显的变化，但乳化稳定性均有明显下降。浓度为0.1%(w/v)的脱脂乳粉、单酶修饰脱脂乳粉、双酶修饰脱脂乳粉的乳化活性分别为26.67、26.90、25.96m2/g蛋白质，乳化稳定性分别为34.33%、33.79%、34.04%。脱脂乳粉的单酶修饰产物的乳化活性略有升高，而双酶修饰产物的乳化活性有所下降，但变化都很小，差异并不显著。2种酶修饰产物的乳化稳定性与原料脱脂乳粉基本相同，无明显差异。

　　3讨论

　　3.1酶修饰产物的体外消化

　　体外消化基于对胃肠道环境的模拟来评价食品蛋白的营养性，是评价蛋白营养价值的重要指标。因此，研究各种改性方法对乳清蛋白消化能力的影响是非常必要的。本研究采用体外消化的方法评价了单酶体系和双酶体系处理对乳蛋白消化性的影响，采用一步水解法(胃蛋白酶)和两步水解法(胃蛋白酶-胰蛋白酶)水解修饰乳蛋白，检测蛋白水解物上清液在280nm处吸光度值，能够反映出蛋白质经酶水解后释放的肽链量，以此来分析酶修饰产物在胃肠道内的消化利用情况。经分析结果发现，无论是单酶体系修饰乳蛋白还是双酶体系修饰乳蛋白，修饰产物的消化能力与原料相比都没有受到损害，反而有所提高。

　　其中，单酶体系修饰的乳清蛋白产物在一步水解和两步水解之后，消化能力要强于双酶体系修饰的乳清蛋白产物，但2种酶修饰乳清蛋白的消化能力均高于原料乳清蛋白。在一步水解检测结果中，2种酶法修饰的脱脂乳粉和原料脱脂乳粉的消化能力基本相同，没有明显差异;而两步水解的结果表明，双酶体系修饰脱脂乳粉的消化能力与原料脱脂乳粉相比没有明显变化，但单酶修饰产物的消化性有明显提高。消化能力的提高，可能是因为酶的修饰作用使蛋白的部分结构发生伸展，从而易于被胃蛋白酶和胰蛋白酶分解利用。Liu等[14-15]的研究也发现改性后乳清蛋白的消化性增加。由以上分析可以看出，酶法修饰乳蛋白并不会损害乳蛋白的消化能力。

　　3.2酶修饰产物的疏水性

　　蛋白质分子是由各种氨基酸相互联接并折叠卷曲成特定的空间结构而形成的生物大分子，其中疏水相互作用是支撑蛋白质三级结构主要的作用力之一。蛋白质的表面疏水性主要与蛋白质分子表面疏水性氨基酸残基的分布情况有关，若蛋白质分子表面的疏水性氨基酸残基较少或尚未形成较连续的疏水区域，则蛋白质在界面的吸附力也较差[16]。表面疏水性能反映出蛋白质分子所发生的化学或物理变化，因此是评价蛋白质变性的一个重要参数[17-18]。

　　本研究利用外源荧光探针ANS对酶修饰产物的固有荧光性进行定量测定。结果表明，单酶体系修饰的乳清蛋白表面疏水性要比双酶体系修饰乳清蛋白略高，而脱脂乳粉的双酶体系修饰产物要高于单酶体系修饰产物，总体分析经酶法修饰的蛋白产物的表面疏水性均比其相应的原料蛋白高，结果与固有荧光性的分析结果一致。酶法修饰改变了蛋白质的结构，蛋白质之间交联后蛋白分子结构展开，蛋白分子内部的非极性氨基酸残基暴露出来，使修饰产物表面疏水性增大[19]。

　　Hiller[20]的研究表明，与原料蛋白相比，经3种氧化酶(包括转谷氨酰胺酶、漆酶和葡萄糖氧化酶)分别交联处理后的乳清分离蛋白和全牛乳蛋白的表面疏水性均得到提高，并指出这是由于聚合作用导致蛋白质结构展开，埋藏在蛋白质结构内部的疏水性氨基酸暴露的结果。这与本研究得到的结果一致。

　　3.3酶修饰产物的乳化性

　　蛋白质和油脂是食品的重要组成部分，它们的存在状态和相关作用会影响蛋白质的乳化性质，从而影响蛋白质在食品工业的应用。在食品所在的乳化体系中，蛋白质能够使油水之间的界面张力得到减小，从而降低了体系中油滴的聚集作用，使体系的稳定性得到提高。但是蛋白质要溶解并存在于两相界面区域，才能在界面性质中起作用，因此蛋白质的乳化能力随其溶解性增大而提高，不易溶解的蛋白质对乳化能力作用影响不大。

　　本研究是通过测定EAI和ESI来考察酶修饰对乳蛋白的乳化性能的影响。结果表明，相比于原料乳清蛋白，乳清蛋白单酶体系和双酶体系的修饰产物的乳化活性没有明显的变化，但乳化稳定性有明显下降。脱脂乳粉的单酶修饰产物的乳化活性略有升高，而双酶修饰产物有所下降，但变化都很小，差异并不显著。2种酶修饰产物的乳化稳定性与原料脱脂乳粉基本相同，无明显差异。分析乳清蛋白酶修饰产物乳化稳定性下降的原因，可能是因为酶催化蛋白质反应过程中，蛋白质发生交联，生成了大分子聚合物，降低了修饰产物的溶解性，因而导致了其乳化活性和乳化稳定性的降低。Hiller[20]的研究采用漆酶、葡萄糖氧化酶交联酪蛋白的乳化稳定性分别降低了53%与75%，与本研究结果一致。

　　4结论

　　通过本研究得出以下结论：酶修饰乳蛋白产物的乳化活性没有明显变化，但乳清蛋白修饰产物的乳化稳定性有明显降低;酶法修饰乳蛋白产物的体外消化性和表面疏水性相比于原料蛋白都有较为明显的上升。本研究为乳蛋白加工过程中功能性质的改善提供了一种新途径，对拓宽乳蛋白在食品加工产业中的应用具有实际的理论指导意义和应用价值。

　　参考文献：

　　[1]金律.酶解乳蛋白在婴儿配方乳粉中的应用[J].食品安全导刊,2014,15(8):42-43.

　　[2]NivalaO,MäkinenOE,KruusK,etal.Structuringcolloidaloatandfababeanproteinparticlesviaenzymaticmodification[J].FoodChemistry,2017,231.

　　[3]黎芳,刘佳,王冉冉,等.葡萄糖氧化酶对全麦面团及全麦馒头品质改良的研究[J].食品工业科技,2019,(14):78-83.

　　[4]ChenL,LiY,HanJ,etal.Influenceoftransglutaminaseinducedmodificationofmilkproteinconcentrate(MPC)onyoghurttexture[J].InternationalDairyJournal,2018,78:65-72.

　　食品生产论文投稿刊物：《食品安全导刊》杂志由中国商业联合会、北京肉类食品协会主办，是国家新闻出版总署正式批准的、一本全面关注食品安全技术、知识的专业期刊。本刊围绕行业与领域、产业与市场、产品与技术，关注食品加工生产到流通销售产业链安全。杂志读者覆盖食口吃地业所有门类的生产加工企业，流通销售企业，食品原辅料供应企业，包装/加工机械企业，种植养殖企业，食品安全监管、检验、检测、认证、科研、教育培训等机构，政府监管部门等。