婴幼儿奶粉中苯并[a]芘检测技术研究及含量调查

　　摘要:目的建立婴幼儿奶粉中苯并[a]芘检测技术，并对市售奶粉中苯并[a]芘含量进行调查分析。方法婴幼儿奶粉在碱性条件下用乙醚-石油醚(1∶1，V/V)提取，然后用1.5mol/L氢氧化钾乙醇溶液皂化，固相萃取柱净化后，经DB-EUPAH色谱柱(20m×0.18mm×0.14μm)分离后气相色谱质谱法检测，D12-苯并[a]芘内标定量。

　　结果当婴幼儿奶粉中苯并[a]芘加标0.3、1.0和5.0μg/kg时，平均回收率分别为116.7%、86.0%、96.4%，相对标准偏差为10.5%、4.2%和4.4%(n=6)。方法定量限为0.3μg/kg，检出限为0.1μg/kg，采用本方法对市售的40份国产及进口婴幼儿奶粉进行测定，苯并[a]芘含量范围为<0.1～0.25μg/kg，检出率为32.5%。结论本方法简便快速准确，净化效果好，灵敏度高，满足婴幼儿奶粉中苯并[a]芘检测要求。目前市售婴幼儿奶粉中苯并[a]芘含量处于较低水平。

　　关键词:婴幼儿奶粉苯并[a]芘气相色谱质谱法

　　食品检测多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是“优先级”环境和食品污染物，是分布最广的一类致癌物。食品中的PAHs不仅源于环境的污染，还源于食品加工、储存和烹饪过程的污染[1-2]。婴幼儿奶粉原料乳和配料中植物油(如椰子油、棕榈油等)易受到PAHs污染，加工过程热处理可能产生多环芳烃[3]，因为奶粉在婴幼儿膳食中的重要贡献，成为国内外监管重点关注的食品。欧盟法令No.835/2011规定婴幼儿奶粉和牛奶中苯并[a]芘不能超过1.0μg/kg[4]，推荐的检测方法包括液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)、气相色谱质谱法(gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)，要求方法达到的检出限为0.1μg/kg[1]。

　　我国的GB2762—2017《食品安全国家标准食品污染物限量标准》未对婴幼儿食品(包括奶粉)中苯并[a]芘进行限量规定，还缺乏我国婴幼儿奶粉中苯并[a]芘含量基础数据。GB5009.27—2016《食品安全国家标准食品中苯并[a]芘的测定》[5]和GB5009.265—2016《食品安全国家标准食品中多环芳烃的测定》[6]均可以测定食品中苯并[a]芘，包括HPLC法[2-3，5，7]和GC-MS法[2，6，8-10]，但这两个标准均未涉及婴幼儿奶粉，且方法前处理、灵敏度不能满足欧盟婴幼儿奶粉苯并[a]芘1.0μg/kg限量、检出限0.3μg/kg、回收率50%～120%要求[1]。本研究旨在建立婴幼儿奶粉中苯并[a]芘准确、快速且操作简便的GC-MS测定方法，同时对杭州市售的婴幼儿奶粉中苯并[a]芘含量进行调查。

　　1材料与方法

　　1.1样品和试剂

　　20.0μg/mL苯并[a]芘标准甲醇溶液购自国家标准物质中心;10.0μg/mLD12-苯并[a]芘内标溶液(购自德国Dr.Ehrenstorfer公司)，橄榄油多环芳烃标准物质(编号T0665QC，购自上海博尼生物科技有限公司)，固相萃取柱(二乙烯基苯聚合物+N-丙基乙二胺250mg/6mL，购自康源科技有限公司)。丙酮、异辛烷、乙酸乙酯、正己烷均为色谱纯(购自MERCK美国)，无水乙醇、无水乙醚、石油醚、浓氨水、氢氧化钾、无水硫酸钠均为分析纯(购自国药)，超纯水(Milli-Q，美国Millipore公司)。40份国产及进口婴幼儿奶粉购自杭州超市。

　　1.2仪器6890GC-5973MS气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司);色谱柱DB-EUPAH毛细管色谱柱(20m×0.18mm×0.14μm，美国Agilent公司);多样品漩涡振荡器(德国Heidolph);高速离心机(美国Beckman公司);固相萃取装置(CNW公司)，氮吹仪(上海安谱公司)，分析天平(感量0.01g，MettlerToledo公司);超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

　　1.3标准溶液的配制

　　1.3.10.2μg/mL苯并[a]芘标准使用液吸取0.25mL20.0μg/mL苯并[a]芘标准甲醇溶液，用丙酮定容至25mL，4℃避光保存。

　　1.3.20.1μg/mLD12-苯并[a]芘内标溶液吸取0.25mL10.0μg/mLD12-苯并[a]芘内标溶液，用丙酮定容至25.0mL，4℃避光保存。

　　1.3.3标准工作液分别吸取0.2μg/mL苯并[a]芘标准使用液2.5、5、10、25和50μL，再加入50μL0.1μg/mLD12-苯并[a]芘内标溶液，用丙酮-异辛烷(1∶1，V/V)补充至100μL，浓度范围为10～100ng/mL(含D12-苯并[a]芘50ng/mL)，混匀后进行GC-MS测定。

　　1.4样品处理

　　1.4.1提取

　　参考GB5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[12]第三法碱水解法，称取2.00g(精确至0.01g)奶粉于50mL离心管中，加入50μL0.1μg/mLD12-苯并[a]芘内标溶液，加10mL水，涡旋后在45℃的水浴中放置10min，溶解后加2mL氨水充分混匀，缓慢加入10mL无水乙醇彻底地进行混匀，加入8mL无水乙醚，涡旋振荡5min，再加入8mL石油醚，涡旋振荡5min，然后放入离心机中，8000r/min离心5min，吸出上层有机相，在40℃的水浴下氮气吹干溶剂得到脂肪提取物。

　　1.4.2皂化[2，6]脂肪提取物中加入5mL1.5mol/L氢氧化钾乙醇溶液，涡旋混匀，70℃水浴放置3min，取出用自来水冷却至室温后加入5mL正己烷、4mL水，涡旋提取2min，10000r/min离心2min，上层正己烷相提取液待净化。

　　1.4.3净化[2，6]在固相萃取柱上加1.0g无水硫酸钠，用3mL二氯甲烷、3mL正己烷依次淋洗活化柱子，活化结束后吸取上述正己烷相提取液转移到固相萃取柱上，控制流速在1.0mL/min左右，待过柱后，用4ml正己烷淋洗除杂，最后用5mL二氯甲烷-乙酸乙酯(1∶1，V/V)洗脱收集于10mL锥底玻璃试管内，洗脱液在40℃下用氮气吹干，加50μL丙酮-异辛烷(1∶1，V/V)溶解残留物，转移至进样瓶中，待GC-MS分析。

　　1.4.4空白试验

　　在不取样品的情况下，与样品一起进行空白试验。

　　1.4.5质量控制

　　称取0.5g橄榄油多环芳烃标准物质，加入50μL0.1μg/mLD12-苯并[a]芘内标溶液，然后按照1.4.2皂化、1.4.3净化后测定。

　　1.5仪器条件[2，6]

　　1.5.1色谱条件

　　色谱柱DB-EUPAH毛细管(20m×0.18mm×0.14μm，美国Agilent公司);进样口温度280℃;载气氦气，纯度≥99.999%;进样体积2μL，不分流进样，溶剂延迟时间为25min;柱温程序:初温80℃，保持2min，以10℃/min升至250℃，保持2min，以8℃/min升至320℃，保持5min。

　　1.5.2质谱条件

　　离子源:电子轰击源(EI);电离能量为70eV;离子源温度230℃;传输线温度280℃;四级杆温度150℃;监测离子:苯并[a]芘定量离子(相对丰度)为252(100)，定性离子250(20)、253(20)，D12-苯并[a]芘定量离子为264(100)，定性离子为260(20)，样品中目标化合物的定性离子与定量离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过20%。

　　2结果

　　2.1仪器分析

　　采用DB-EUPAH色谱柱，在本实验条件下苯并[a]芘及D12-苯并[a]芘内标质量色谱。

　　2.2质量控制

　　目前还没有奶粉中苯并[a]芘标准物质，用低含量橄榄油多环芳烃标准物质进行内控，三次测定苯并[a]芘平均结果为1.56μg/kg，橄榄油标准物质苯并[a]芘赋值为1.61μg/kg，含量范围为0.90～2.32μg/kg，说明本方法测定结果准确可靠。

　　2.3方法线性范围和检出限

　　在本仪器条件下对标准工作液进行测定，测得苯并[a]芘和内标物D12-苯并[a]芘的相应峰面积，在10～100ng/mL浓度范围内，苯并[a]芘与内标D12-苯并[a]芘的浓度比为横坐标x，以苯并[a]芘峰面积与内标D12-苯并[a]芘峰面积比(响应比)为纵坐标y，线性方程为y=0.276x+0.004，r2=0.997。在婴幼儿奶粉中苯并[a]芘加标0.3μg/kg测定6次，苯并[a]芘平均信噪比(S/N)为22.6。另外基于苯并[a]芘无处不在，整个空白试验含量在未检出～0.1μg/kg之间，因此确定本方法定量限为0.3μg/kg，检出限为0.1μg/kg(S/N=6)，婴幼儿奶粉及加标(0.3μg/kg)测定叠加图。

　　2.4准确度和精密度实验

　　对空白婴幼儿奶粉进行苯并[a]芘加标0.3、1.0和5.0μg/kg回收试验，方法准确度、精密度实验结果。

　　2.5样品测定

　　对市售的40份国产及进口婴幼儿奶粉进行苯并[a]芘含量分析，其中12份国产、28份进口奶粉。结果苯并[a]芘检出率32.5%，含量范围为<0.1～0.25μg/kg，均小于欧盟婴幼儿奶粉中苯并[a]芘1.0μg/kg限量规定。

　　3讨论

　　测定食品、环境中苯并[a]芘等多环芳烃的方法主要有HPLC荧光检测器法、GC-MS等[1]。欧盟对婴幼儿奶粉中苯并[a]芘限量要求严格，且奶粉基质复杂，因此要求方法灵敏度、准确度高。GC-MS抗干扰能力强，采用同位素内标定量更加准确，本方法采用同位素稀释GC-MS测定婴幼儿奶粉中苯并[a]芘能满足要求。

　　婴幼儿奶粉中苯并[a]芘等多环芳烃的提取有直接皂化法[3，9]、溶剂提取法[8]、分散固相萃取法[7]等。婴幼儿奶粉生产工艺复杂，配料多，且含有较高脂肪，溶剂提取法存在提取不完全等问题，本次采集的40份婴幼儿奶粉脂肪含量在22.3%～29.5%，平均含量为25.6%，基本与标签标识的脂肪含量相一致。

　　由于苯并[a]芘等多环芳烃属于脂溶性化合物，多与脂肪类化合物共存，DOBRINAS等[8]和娄婷婷等[10]采用溶剂提取后不净化直接进样GC-MS分析，杂质干扰大，且对仪器、色谱柱损伤大，灵敏度下降快。本方法参考GB5009.6—2016食品中脂肪的测定，先用碱水解提取奶粉中脂肪，然后进行皂化除去脂肪，固相萃取进一步净化除去干扰，使得方法简便，且具有较高的灵敏度、准确度。苯并[a]芘等多环芳烃是环境污染物，无处不在，空白值对低含量的婴幼儿奶粉测定影响非常大，在实验过程必须严格加以控制。试剂、器皿、浓缩装置等是空白值的主要来源。

　　为了降低实验过程苯并[a]芘空白值，玻璃容器可以通过400℃高温烘烤或者正己烷淋洗除去，浓缩装置用丙酮等充分清洗干净。同时减少试剂用量，减少实验转移步骤来控制污染[2]。本实验条件下空白实验苯并[a]芘含量小于方法检出限0.1μg/kg，有效保证结果的准确性。

　　综上所述，本方法采用碱水解、皂化后固相萃取净化，同位素内标稀释法结合GC-MS法测定婴幼儿奶粉中苯并[a]芘，方法操作简便，净化效果好，定性定量准确，方法定量限为0.3μg/kg，检出限为0.1μg/kg，完全满足欧盟对婴幼儿奶粉中苯并[a]芘1.0μg/kg限量规定。监测显示市售婴幼儿奶粉中苯并[a]芘处于较低水平。

　　参考文献

　　[1]EuropeanFoodSafetyAuthority.PolycyclicAromaticHydrocarbonsinFoodScientificOpinionofthePanelonContaminantsintheFoodChain.[EB/OL].[2019-05-30].

　　[2]吴永宁.食品中有机污染物检测方法标准操作程序[M].北京:中国质检出版社，2018.

　　[3]CHOHK，SHINHS.EvaluationofpolycyclicaromatichydrocarboncontentsandriskassessmentforinfantformulainKorea[J].FoodSciBiotechnol，2012，21(5):1329-1334.

　　[4]CommissionRegulation(EU).No835/2011of19August2011.amendingRegulation(EC)No1881/2006asregardsmaximumlevelsforpolycyclicaromatichydrocarbonsinfoodstuffs[S].Brussels:CommissionRegulation(EU)，2011.

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