玫瑰组织培养和遗传转化的研究进展

　　摘要：玫瑰是一种重要的药食兼用植物，栽培历史悠久，被广泛种植用于提取精油，具有较高的观赏价值、经济价值和药用价值。玫瑰常规以扦插、分株、嫁接等方法繁殖，繁殖率较低，建立玫瑰组织培养体系可提高繁殖速度，有利于进行工厂化育苗。在玫瑰遗传转化方面，以农杆菌介导法应用最多，已获得转基因株系。本研究总结了前人在玫瑰组织培养中外植体选择、外植体消毒、培养条件、初代培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽以及遗传转化等方面的研究成果，提出了目前研究中存在的问题，并对未来研究方向和产业应用前景进行了展望，以期为玫瑰组织培养研究、遗传转化体系建立以及工厂化育苗等工作的开展提供借鉴和帮助。

　　关键词玫瑰;组织培养;遗传转化

　　玫瑰为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物，是重要的药食兼用植物，在生态涵养、景观绿化、食品化工、医药保健等方面起着重要作用，以重瓣红玫瑰(Rosarugosa„Plena‟)、大马士革玫瑰(R.damascene)等为代表，其主要的商业用途为提取玫瑰精油(徐立军等,2015,河北林业科技,(2):19-21)。中国是玫瑰种植大国，玫瑰资源丰富，品种繁多，山东平阴、北京妙峰山、甘肃苦水、新疆是国内主要的玫瑰种植地区。

　　农业栽培论文范例：玫瑰香葡萄汁冷冻浓缩响应面工艺优化与品质研究

　　目前，玫瑰产业品种退化等问题制约产业发展。同时，玫瑰存在着种间杂交亲和力低、种子萌发弱以及种子幼苗成活困难等问题，其传统繁殖方式(嫁接,扦插以及分株等)繁殖周期长且病虫害严重，不利于工厂化种苗生产(霍书新等,2007)。植物组织培养是一种利用植物细胞全能性来进行快速繁殖的技术，应用组织培养技术快速繁殖优质种苗是一种行之有效的措施(李坤峰等,2014;陈宇杰等,2019,宁波大学学报(理工版),32(1):1-5)。此外，植物组织培养作为高效再生体系建立的重要环节，它通过控制再生体系的稳定性与再生频率的高低，直接影响遗传转化效率(胡选萍等,2018)。

　　采用组织培养进行玫瑰种苗繁殖具有速度快、种苗脱毒等优势，可以加速品种更新换代，促进玫瑰种植业更快更好地发展(尹利方等,2016,江西农业,(19):59)。目前，国内外学者对玫瑰组织培养进行了多方面的研究，在大马士革玫瑰(R.damascene)、重瓣红玫瑰(R.rugosa„Plena‟)等品种中均有报道，前人以茎段等为外植体，探究了腋芽萌发、增殖、生根培养的最佳培养基配方、炼苗移栽方法及培养条件，建立了组织培养技术体系，为生产应用提供了科学依据(李雪,2014;黄颖等,2014;陈宇杰等,2019,宁波大学学报(理工版),32(1):1-5)。

　　近年来，关于玫瑰遗传转化的研究报道较少，对玫瑰组织培养和遗传转化的研究进展也缺乏系统的的归纳和总结。本研究对玫瑰组织培养及遗传转化研究现状进行了综述，对目前存在的问题、未来研究方向及应用前景进行了探讨，以期为玫瑰的快速繁育、遗传转化以及工厂化快速育苗等提供参考。

　　1玫瑰组织培养

　　1.1外植体选择

　　外植体类型、取样时期均会影响玫瑰离体组织培养体系的建立，组培苗的再生率、污染率也存在很大差异，选择合适的外植体类型和采样时间尤为关键(贾玉娟等,2018,林业科技通讯,(9):22-26)。已报道的玫瑰离体快繁的外植体主要包括玫瑰(R.rugosa)的茎段(Xingetal.,2010)、大马士革玫瑰(R.damascene)的茎尖、茎段以及叶片(赵蓓蓓等,2011,园艺学报,38(S):2630;黄颖等,2014)、野生玫瑰(R.rugosa)的茎段(杨丽娟等,2010)、苦水玫瑰(R.sertata×R.rugosa)的茎段(张武等,2018)、重瓣红玫瑰(R.rugosa„Plena‟)的茎段(杨博,2003,中国农业大学,pp.25-26)、墨红玫瑰(R.chinensis„CrimsonGlory‟)的茎段(靳松等,2015)、紫枝玫瑰(R.rugosa„ZiZhi‟)的茎段(朱翠英等,2005)、以及滇红食用玫瑰(R.rugosa„Dianhong‟)的茎尖和茎段(李晓亮等,2015)等。玫瑰不同类型的外植体组织培养效果差异较大，可能与玫瑰的品种、植物激素等相关。

　　同一品种的不同茎段取材部位也会影响到玫瑰组织培养的成功率，其中，当年生枝条上部和中部的带芽茎段、茎尖褐变率低，是适于组织培养的理想材料(贾玉娟等,2018,林业科技通讯,(9):22-26)。玫瑰外植体取样时间需兼顾外植体的再生能力和组培污染率等两方面，宜在玫瑰再生能力强、携带病菌少的季节进行。对于茎段的组织培养，在芽休眠末期或者萌动初期效果最佳。已有研究对比新疆7月、9月以及11月不同时间采集的接种材料萌发率，发现11月采集的枝条腋芽萌发率最高，达到了84.2%(黄颖等,2014)。

　　由于不同地域气候的差异，各地适合玫瑰外植体取样时间也存在差异。在陕西地区，玫瑰茎段外植体的最佳选取时间在3~5月及10月中旬，而盛夏季节最不适于玫瑰组培(于福科和张广军,2002,陕西农业科学,(11):47-48)。在山东地区，4~12月份，外植体污染率逐渐上升，其中，4~9月份以细菌性污染为主，10~12月份枝条逐渐进入休眠，霉菌污染率逐渐升高，4月份是取样的最佳时期(卢绪娟,2007)。

　　1.2外植体消毒

　　对于木本植物而言，组织培养最具挑战的是无菌体系的建立(胡选萍等,2018)。消毒方式(消毒剂种类,浓度和消毒时间)的选择对于植物组织培养的成败起着至关重要的作用(汪腾越等,2012)。外植体消毒包括消毒剂浸泡处理、无菌水清洗等步骤，其中，75%乙醇(C2H5OH)、升汞(HgCl2)、次氯酸钠(NaClO)等是玫瑰外植体的主要消毒剂。在消毒效果方面，升汞的效果最佳，次氯酸钠次之。尽管升汞的消毒效果显著，但它对人体存在极大的毒性，近年来被严格管控使用，而次氯酸钠毒性低于升汞，高效广谱，被广泛使用。另外，在消毒剂处理前，对外植体表面进行清洗，也可降低污染率(邢文等,2014)。

　　玫瑰茎段消毒后宜切除两端接触消毒剂的部位，再进行组织培养，可减少携带的病菌，提高组织培养的成功率。外植体消毒时间尤为关键，不同玫瑰品种对消毒灭菌所能承受的时间存在差异。消毒时间过短，易出现消毒杀菌不彻底等问题，而时间过长会导致外植体的褐化死亡(贾玉娟等,2018,林业科技通讯,(9):22-26)。在玫瑰茎段消毒中，0.1%~0.2%升汞的消毒时间宜在5~8min，2%次氯酸钠的消毒时间在20min左右，消毒效果最佳(孟长军,2012,中国园艺文摘,28(8):177-178)。

　　以叶片进行体细胞胚组织培养时，叶片为茎段组培苗的无菌叶，不需要外植体消毒(Xingetal.,2014a)。以种子合子胚为外植体时，需对玫瑰种子进行70%乙醇消毒1min、1%次氯酸钠溶液消毒15min等处理，以获得无菌外植体(Kimetal.,2009)。除了消毒剂的选择、消毒时间的控制，对外植体低温预处理也有助于消毒充分，降低污染率。将玫瑰枝去叶剥刺后置于冰箱低温处理7d，再进行消毒，发现该方法可有效降低污染，减轻褐变，也不影响茎段腋芽的萌发(于福科和张广军,2002,陕西农业科学,(11):47-48)。相关研究证实，在升汞或次氯酸钠消毒过程中添加表面活性剂吐温20(Tween-20)，可显著提高消毒效果(杨博,2003,中国农业大学,pp.25-26)。

　　1.3培养条件

　　温度、光照、湿度及pH值等是组织培养体系成功建立的重要环境因素。玫瑰的初代培养以MS为基本培养基，增殖培养主要以MS、WPM为基本培养基，生根培养主要以1/2MS为基本培养基(徐立军等,2015,河北林业科技,(2):19-21)。基本培养基通常添加20~30g/L蔗糖、6~12g/L琼脂，pH为5.8~6.2(杨博,2003;卢绪娟,2007)。温度是组织培养的关键环境因子，生根阶段对温度的变化非常敏感，过高过低的温度会导致嫩茎生根数量减少(姚晓惠等,2002,农业与技术,(5):25-28)。

　　在培养室温度(25±2)℃、湿度30%~45%、光照时间12h/d条件下，玫瑰组织培养效果较好(李晓亮等,2017)。适宜的光照强度是玫瑰组培苗正常生长的必要条件，2000~3000lx的光照强度为最佳光强范围(卢绪娟,2007)。黑暗培养对叶片不定芽的诱导起到重要作用，研究发现，最适合玫瑰不定芽诱导的暗培养时间为10~15d，在暗培养结束后，外植体继续在诱导培养基上转入光照培养，15~20d后再转入增殖培养基，培养效果最好(邢文等,2014)。

　　1.4初代培养

　　初代培养是植物组织培养过程中必不可少的一个环节，又称为启动培养。选择合适的培养基和植物生长调节剂，能促进茎段腋芽的萌发，也能促进叶片快速、大量地产生不定芽，实现植物快速无性繁殖(陈宇杰等,2019,宁波大学学报(理工版),32(1):1-5;李雪等,2020)。在茎段腋芽萌发中，使用的植物生长调节剂包括细胞分裂素类的6-苄氨基嘌呤(6-BA)、玉米素(ZT)、噻苯隆(TDZ)、二氯苯氧乙酸(2,4-D)等，生长素类的α-萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)和赤霉素(GA3)等。6-BA与NAA两种植物激素在玫瑰初代培养中最适浓度、比例的研究较为深入。

　　有研究以玫瑰幼嫩叶片为外植体，建立不定芽再生体系，发现6-BA是影响愈伤组织质量的主要因素(卢绪娟,2007);在玫瑰嫩茎基部直接再生芽苗的诱导研究中，也发现6-BA的浓度尤为关键，过高浓度的6-BA会抑制玫瑰芽苗再生(李敏等,2016,江苏农业科学,44(6):81-83)。

　　6-BA最适浓度因品种而存在差异，如重瓣红玫瑰为1.5mg/L(陈宇杰等,2019,宁波大学学报(理工版),32(1):1-5)，紫枝玫瑰为0.4mg/L(朱翠英等,2005)。在初代培养中，NAA浓度通常低于6-BA浓度，以0.02~0.3mg/L较适宜。黄颖等(2014)在MS培养基中添加不同浓度NAA，发现NAA浓度为0.1mg/L时，腋芽萌发率较高，可达到97.5%。植物激素TDZ是玫瑰叶片愈伤组织再生不定芽的必要条件(卢绪娟,2007)，当TDZ浓度为1.5mg/L诱导时，叶片不定芽诱导效果最佳(邢文等,2014)。

　　1.5增殖培养

　　在玫瑰的继代増殖培养阶段，不同生长调节剂配比是影响丛生芽继代増殖的关键(Kimetal.,2009;李雪,2014;邢文等,2014)。增殖培养使用的生长调节剂主要是NAA、6-BA、GA3与2,4-D等，丛生芽的发生源主要为腋芽和不定芽。6-BA和NAA的浓度影响增殖效果，当6-BA浓度为0.5~3.0mg/L、NAA浓度为0.01~0.1mg/L时，增殖效果较佳。

　　在WPM培养基中，6-BA在0.6~1.5mg/L时，苦水玫瑰的丛生芽增殖倍数随6-BA浓度的增加呈逐步上升趋势，其中，6-BA浓度达到1.5mg/L时，丛生芽的增殖系数最高，为3.56(张武等,2018)。大马士革玫瑰芽苗增殖系数随6-BA和NAA浓度的提高而增加，其中WPM+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L为最佳的继代增殖培养基(徐立军等,2015,河北林业科技,(2):19-21)。

　　在MS培养基中，6-BA浓度为1.0mg/L时，大马士革玫瑰新芽的增殖能力最强，增殖系数最大，为4.2(黄颖等,2014)。增殖效果最佳的6-BA浓度可能与玫瑰品种、培养基类型等因素相关。植物激素的选择也影响到愈伤组织增殖、不定芽再生。

　　TDZ有利于诱导玫瑰愈伤组织再生不定芽，相比TDZ，6-BA不能诱导不定芽，但有利于不定芽增殖再生，2,4-D对不定芽的再生有显著的抑制作用，MS+TDZ2.0mg/L+IBA0.1mg/L是玫瑰叶片愈伤组织再生不定芽的适宜培养基(卢绪娟,2007)。在不定芽增殖培养中，低浓度6-BA和NAA组合下增殖效果较佳(张娜等,2011)。

　　邢文等(2014)发现，叶片愈伤组织分化出的不定芽在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L培养基上增殖培养，均能形成幼苗。不同的是，以合子胚为外植体进行增殖继代培养时，使用的培养基为1/2MS+2,4-D2.26μmol/L培养基(Kimetal.,2009)。在基于体细胞胚再生体系建立的遗传转化中，发现抗生素浓度对体细胞增殖存在影响，抗生素浓度过高，体细胞增殖困难，甚至褐化死亡(邢文等,2014,中国园艺学会观赏园艺专业委员会,pp.209-216)。

　　此外，培养基类型、植物激素种类和配比、葡萄糖浓度等也都会影响体细胞胚的增殖，体细胞胚在MS+2,4-D1.0mg/L+BA0.01mg/L+葡萄糖45g/L培养基上增殖效果最佳(Xingetal.,2014a)。Xing等(2014b)应用了这种培养基进行体细胞胚增殖培养，用于培育转基因玫瑰。

　　1.6生根培养

　　相比初代培养和增殖培养两个阶段，玫瑰组织培养中的生根培养更为困难。近年来关于生根培养的研究主要围绕植物生长调节剂种类及配比的筛选以及根褐化机理分析等方面开展，已取得了一定的进展。NAA、IBA、6-BA和2,4-D是诱导生根的主要植物生长调节剂，其配比在不同玫瑰品种生根培养中存在差异。

　　据报道，NAA和IBA与促进植物细胞分裂和根的分化相关，6-BA与细胞分裂、顶端优势改变以及芽的分化等有关(李晓亮等,2015)。尽管IBA也具有促进生根的作用，研究发现，利用IBA诱导的根系普遍较为细弱，NAA比IBA更利于促进玫瑰生根(李雪,2014)。

　　NAA对大马士革玫瑰不定芽生根率及生根数影响显著，芽苗生根率随NAA浓度提高而降低，平均生根数随NAA浓度的提高而增加(徐立军等,2015,河北林业科技,(2):19-21)。这与黄颖等(2014)的研究报道一致，当NAA浓度增大时，其生根率却降低，表明生根培养时NAA浓度不宜过高。ABA激素和IAA、IBA或NAA等多种激素同时使用不能促进大马士革玫瑰生根，而单独添加2,4-D激素可有效诱导生根，在MS+2,4-D2.5mg/L生根培养基上培养2周后，转入无植物激素的MS培养基继续培养，根系生长效果较好(JabbarzadehandKhosh-Khui,2005)。

　　1.7炼苗移栽

　　炼苗移栽是玫瑰组培苗由无菌的培养基环境向露地栽培转变的重要环节。玫瑰组培苗与大田苗在形态和组织上存在差异，如组培苗无根毛，叶片角质层不发达且移栽初期保水能力差等(卢绪娟,2007)。炼苗驯化可促进玫瑰组培苗适应外界环境。研究发现，炼苗的方法和时间直接影响试管苗的移栽成活率(赵鑫等,2007)。

　　炼苗方法总结为：将培养幼苗的组培瓶在组培室内揭盖，培养2~3d，再将组培瓶转移到栽培环境培养3d左右，可实现玫瑰组培苗的炼苗驯化。炼苗后的组培苗移栽时需要清洗根部的培养基，对移栽基质消毒杀菌，移栽期间需注意保持温度和湿度。移栽方法总结为：用5mg/L高锰酸钾溶液洗去组培苗根部的培养基，再转移到100倍多菌灵消毒过的腐烂松针、泥炭土和细河砂(1:2:1)混合的移栽基质中，薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在70%~80%，温度控制在(20±2)℃，每天自然光照9h，3d后通风换气，7d后揭膜，每天适时喷洒清水2次，成活率可达95%以上(杨丽娟等,2010)。

　　2玫瑰遗传转化

　　遗传工程技术对改良现存玫瑰品种显示了极大的潜力，通过导入外源基因，改善抗病性、花香、花期、精油品质等性状。体细胞胚胎发生是细胞工程中植株再生的重要途径之一(贾彩凤等,2004)。以叶片等材料诱导出初生体细胞胚，诱导的体细胞胚经增殖培养可形成次生体细胞胚，次生体细胞胚发生过程可为遗传转化提供稳定的胚性材料(Raemakersetal.,1995)。

　　农杆菌介导法是遗传转化的主要方法，利用体细胞发生过程进行遗传转化已在部分蔷薇属植物中应用(Lietal.,2002)。如在月季(Rosahybrida)的遗传转化中，胚状体培养技术已被成功应用(王伏林和胡张华,2003,亚热带植物科学,32(1):65-67)。早在1994年，国外学者利用花丝诱导的体细胞胚与农杆菌共培养，获得了首例转基因月季(Firoozababyetal.,1994)。随后，转花青素相关基因CHS、抗菌蛋白相关基因等的月季也相继被报道(Souqetal.,1996;Dohmetal.,2001)。大部分月季品种以体细胞胚为受体材料进行遗传转化，而玫瑰是以体细胞胚的增殖、萌发再生为基础，以次生体细胞胚为受体材料，利用次生体细胞胚发生体系进行遗传转化(邢文等,2014,中国园艺学会观赏园艺专业委员会,pp.209-216)。

　　3展望

　　玫瑰组织培养是遗传转化体系建立的关键，实现玫瑰的遗传转化可定向培育转基因玫瑰(Xingetal.,2014b;Shenetal.,2019)。此外，将组织培养与辐射诱变结合，建立复合育种技术，也具有应用价值。如对月季茎段进行γ射线辐射诱变后继续进行组织培养，获得了花色突变的月季新品种(BalaandSingh,2013)。这种复合育种技术在玫瑰的遗传改良中还未被报道，具有极大的研究潜力和应用价值。

　　病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)技术是一种RNA水平转录后的基因沉默现象，能够快速鉴定基因功能，目前已在月季中应用，用于鉴定基因功能(任浩然等,2019)。研究发现，VIGS试验中，组培苗相比扦插实生苗能够更高效、快速呈现沉默效果，在进行侵染操作时还具有体积小，较便捷、易操作的优势，可以作为株型、成花诱导等相关基因功能研究的理想材料(丁榕等,2018)。

　　然而，VIGS技术还未被应用于在玫瑰基因功能研究。将VIGS技术与组织培养技术相结合，可为玫瑰基因功能研究提供新思路。近年来，玫瑰产业发展迅速，已成为中国乡村振兴下的特色优势产业。随着玫瑰种植业规模和体系不断扩大，人们对新品种、优质种苗快速繁育方法的需求持续增加。玫瑰组织培养和遗传转化的研究可为工厂化脱毒种苗生产、遗传转化、新品种培育等提供重要的技术支撑，具有极大的发展空间。

　　目前，玫瑰的组织培养和遗传转化还存在的主要问题包括：

　　(1)组培苗边叶黄化、玻璃化、褐化现象较严重;(2)生根困难以及炼苗移栽难以成活;(3)体细胞胚培养体系待优化;(4)遗传转化效率低，转化细胞再生植株再生困难;(5)组织培养和遗传转化在实际生产中应用不足。在今后的研究中，建议从以下几方面进行深入研究：(1)对不同玫瑰品种的组培快繁体系归纳总结、优化与改进，建立高效的再生体系，应用于种苗生产繁育中;(2)加强体细胞胚培养技术研究，结合遗传转化、诱变育种等方法培育玫瑰新品种，丰富玫瑰种质资源;(3)目前农杆菌介导法是玫瑰遗传转化的主要方法，基因枪转化法等转化方法在玫瑰中的研究还较少，未来可探究多样的遗传转化方法，建立高效转化、再生的遗传转化体系;(4)进一步扩大玫瑰组织培养和遗传转化的应用研究，实现工厂化脱毒种苗生产、转基因玫瑰新品种培育。

　　参考文献

　　BalaM.,andSinghK.P.,2013,Invitromutagenesisofrose(RosahybridaL.)explantsusinggamma-radiationtoinducenovelflowercolourmutations,J.Hortic.Sci.BIotech.,88(4):462-468.

　　ChenP.H.,ChenS.B.,ChenL.F.,XuL.P.,WangH.B.,ChenY.Q.,andChenR.K.,2009,Effectofcoconutwateronsugarcanepropagationinvitro,RedaiZuowuXuebao(ChineseJournalofTropicalCrops),30(12):1818-1823.

　　(陈平华,陈舜彬,陈岚凤,许莉萍,王恒波,陈由强,陈如凯,2009,椰乳在甘蔗组培快繁中作用的研究,热带作物学报,30(12):1818-1823.)

　　DohmA.,LudwigC.,SchillingD.,andDebenerT.,2001,Transformationofroseswithgenesforantifungalproteins,ActaHort.,547(547):27-33.DingR.,LiangJ.,ZhaoH.W.,ZhangK.Z.,andCuiJ.T.,2018,ApplicationandoptimizationofVIGSexperimentaltechnologysysteminRosahybrida,ZhongguoNongxueTongbao(ChineseAgriculturalScienceBulletin),34(3):87-92.

　　(丁榕,梁晶,赵和文,张克中,崔金腾,2018,VIGS实验技术体系在月季中的应用及优化,中国农学通报,34(3):87-92.)FiroozababyE.,MoyY.,Courtney-GuttersonN.,andRobinsonN.,1994,Regenerationoftransgenicrose(Rosahybrida)plantsfromembryogenictissue,Nat.Biotechnol.,12(6):609-613.

　　作者：程浩*欧阳琳*苗保河**