生态胁迫促进道地药材质量形成机制与质量评价思路

　　摘要：道地药材以优质而著称，其质量受环境影响较大。中药材由野生转为栽培，导致药材质量下降。药材质量的科学评价是中药产业的基石和传统中医药健康发展的保证，然而中药含有大量不同功效成分和功效相同的多种成分，难以评价质量。根据人体与植物的异同点，对道地药材质量形成机制、道地药材质量复杂性的本质原因以及目前评价药材质量的方法的局限性进行了论述。植物次生代谢产物通常是药材的活性成分，指出其生态作用与药理作用密切相关。道地药材质量评价应选择在人体内相对稳定的成分，以高含量成分与具有代表性的高活性成分相结合的“双高”作为质量标志物(Q-Marker)可更加客观评价道地药材的质量。

　　关键词：中药资源;道地药材;ROS;药材质量;活性成分

　　中医理论是从人体对自身与环境深刻体验出发的，中医治病的原理就是调整人的代谢平衡，更注重宏观的“面”。西医是随着解剖学与化学的发展产生并发展起来的，更注重微观的“点”。医离不开药，2个医疗体系的起源和理论的不同也决定了中药和西药的差异，西药成分较为单一，而中药含有大量不同功效成分和功效相同的多种成分，各种成分的含量和比例变化多样，以致以一种或多成分总量均不能评价药材质量，难以寻找有效的方法。在众多药材中，有些药材的化学成分的变化与环境关系并不密切，各地药材质量差异不大，而有些药材其质量受环境影响很大，其质量具有明显的地域性，不同产地间质量差异显著，这也就是所谓的道地药材[1]。

　　中药论文范例： 中药材之高产栽培防风技术

　　道地药材是以适宜的环境、优良的种质或成熟的生产技术和加工方法为前提，在一定的生产区域内所生产的能够长期地稳定地影响市场需求，并经临床或现代科学技术验证的优质常用中药材[2]。明确道地药材质量形成机制，建立评价道地药材质量的科学方法是中医药健康发展的重要基础。

　　1道地药材质量形成机制

　　达尔文的进化论是19世纪自然科学的3大发现，极大推进了生命科学的发展。根据该学说，生命起源经历了从无机小分子→有机小分子→有机大分子→独立的体系→原始生命，从原始生命开始又经历了从单细胞到多细胞、从低等到高等、从简单到复杂、从水生到陆生的进化过程。

　　新的化石证据动植物的分野至少应该始于10亿年之前。基于此理论，动物和植物应有共同的祖先，也应有相同的基本生命规律。动物细胞和植物细胞生命本质的共同点表现在：都有磷脂双分子层构成的细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、内质网、生命活动都离不开酶、遗传物质均为DNA、生命活动均需复制-转录-翻译等过程，新陈代谢的过程相同、适应环境的抗氧化酶的种类也都相同等，这些共有特征也称为生命的基本特征。

　　不同生物又经过长期的分化，进化出各自特征，属内物种间差异较小，科内差异较大，界间差异最大。动、植物位于2个界，亲缘关系最远，因此动物植物生命活动存在的差异也最大。动物能够通过移动来寻找适宜的环境进行生活，物种的生存主要取决于“食物”来源、物种间争夺食物的竞争，而植物的生存依赖于阳光，不需要移动也可以获得充足的“食物”，阳光易于获得，在足光照的条件下所面临的生存问题常常是干旱、高温等逆境胁迫，因此植物生存面临的主要问题是逆境。植物在漫长的进化过程中进化出了动物所不具备的次生代谢系统，通过次生代谢产物适应逆境，这也是植物药有明显的道地性而动物药无明显道地性的原因[3]。

　　1.1逆境对植物伤害的本质是活性氧(robotoperatingsystem，ROS)植物在逆境胁迫条件下，细胞的叶绿体固定CO2消耗的光能与吸收的光能的平衡常常被打破，造成吸收光能过剩，又由于环境胁迫激素脱落酸导致气孔关闭阻碍了光合作用产生的O2外排，积累的O2被还原成超氧负离子(即Mehler反应)[4]。超氧负离子又可与·OH、H2O2等ROS进行转化。已证实ROS的增加是环境胁迫的结果，在一定条件下超氧负离子可增加了3倍，在一定条件下H2O2增加了10倍[5−6]。

　　这些物质具有很强的氧化能力，被称为ROS，它可以将蛋白质中的不同位置2个氨基酸中的-SH氧化成-S-S-，从而形成维持或改变蛋白质(包括酶)的二级或三级结构来调节各种代谢，因此，适当水平的ROS也是调节植物中各种生理作用的不可或缺的信使，但一旦ROS过度产生，就会产生一系列破坏力，例如改变相邻的分子结构，降低细胞膜的稳定性、破坏DNA链、蛋白质交联、断裂肽链等，结果导致代谢紊乱，甚至细胞死亡[7]。有逆境存在就会有大量ROS，大量ROS也必然对细胞产生伤害，生态胁迫对植物伤害的本质是ROS。因此，ROS具有双重性，过多或过少都是有害的，细胞内含量保持状态。

　　1.2植物抗氧化酶消除ROS的局限性

　　抗氧化酶是将体内形成过氧化物转换为毒害较低或无害的物质多种酶的统称，普遍存在生物细胞中，主要包括超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、各种过氧化物酶(peroxidase，POD)等。在抗氧化酶系统中，植物产生的超氧负离子首先通过SOD的作用生成H2O2，再通过CAT、POD等分解，CAT可单独消除H2O2，而POD需要多酚等电子受体才能消除H2O2。抗氧化酶也是蛋白质。在一定逆境条件下，ROS含量相对较低，抗氧化酶能够发挥较大的抗氧化作用。

　　SOD由2个亚基组成和CAT分别由4个亚基组成，含有多个易发生氧化的−SH基团，严重逆境下较高浓度的ROS会对酶造成很大破坏，使其活性大大降低[7]。甘草对环境的适应能力很强，标志着其具有较强抗氧化能力，研究显示甘草在严重胁迫条件SOD、CAT等活性呈现先上升后下降的规律性变化[8]，其他植物更是如此，说明植物单纯依靠抗氧化酶不可能适应严重逆境，必须需要其他抗氧化物质的参与。这里需要特别指出的是POD。

　　POD虽然也是酶，但该酶与糖结合成结合糖蛋白，糖基化有效防止了蛋白水解，稳定了蛋白构象，使POD稳定性远远强于其它酶[9]，在较强的逆境条件下POD通常仍表现出较高的活性[10-11]。POD的产生需通过逆境条件下诱导，因此也常称为“逆境酶”，但该酶发挥作用也通常需要次生代谢产物提供电子才能发挥作用。研究显示在严重胁迫下该酶活性也会降低[12-13]，所以很多植物单纯依靠抗氧化酶不可能适应严重逆境。

　　1.3次生代谢产物与ROS环境胁迫因子通常为物理因子，这些胁迫因子能够导致ROS的大量产生，而ROS又能调节植物的代谢，因此ROS成为生态环境与生理活动变化之间的媒介物质[14]。黄酮类化合物具有抗辐射伤害、结合植物毒素等功能等功能[15]，其抵御逆境作用机制可能主要有2种：一是黄酮类化合物具有紫外吸收作用，可减少对核酸、蛋白质等大分子的破坏作用，保护植物器官尤其是光合系统免受辐射伤害;二是黄酮类化合物是多酚类化合物，能够清除ROS自由基，从而保护生物膜和蛋白质的结构免受伤害，避免生理代谢紊乱。

　　植物的次生代谢产物具有抵御不良生态环境对细胞伤害的作用，能够缓解营养缺乏，抵御干旱、温度变化、盐害、大气污染、食草动物和病原菌浸染等[16]。五环三萜皂苷具有双亲性，该分子像磷脂分子那样，既含亲水性的头部、又含疏水性(亲脂)的尾部，鸢尾属植物的三萜类物质能够容易整合到磷脂双分子层中，调节膜的流动性，维持细胞膜的整体性[17]，从而削弱脂质过氧化[18]。五环三萜整合到细胞膜现象已经通过膜技术与原子力显微镜研究得到证实[19]。

　　在逆境条件下次生代谢产物是在ROS的诱导下大量产生的，它们的含量变化可提物细高植胞的适应能力。基于动物和植物生命活动的相似性，次生代谢产物的生态作用机制可能就是中药的作用机制，因此次生代谢产物的变化本质也就是道地药材质量的形成机制。由于植物细胞内的ROS含量需要处于一个相对稳定的水平，因此次生代谢产物的含量、抗氧化酶活性等不断变化，最终表现为不同产地、批次道地药材的质量差异很大。

　　2道地药材质量形成的复杂性

　　环境对药材质量有重要影响，在1000多年前的唐代就已经被人们所认识，目前药材质量与环境的关系进行了广泛研究。影响道地药材质量的因素主要是特定的种质和生态环境，但特定的种质也是特定环境下物种适应环境的产物，是长期突变和特定环境下自然选择作用的结果，因此环境是最主要的[20]。传统的观点认为中药材的质量是药用植物在长期的的生长发育过程中逐渐形成的，对某些药材来说，此论断有一定合理性。但是，短暂的生物胁迫也会产生大量的ROS，也会对次生代谢产生更大的影响。

　　2.1生态环境的复杂性

　　次生代谢产物的合成需要大量的能量和物质[21]。植物在适宜的环境条件下大量合成次生代谢产物则会导致初生代谢的减弱，也会影响生物的生长发育，降低生物在自然界中的竞争能力。在逆境条件下减少次生代谢产物的生物合成虽然可以避免较多能量的消耗，但过多ROS的存在也会导致植物不能适应逆境而难以生存。植物体的能量物质是有限的，次生代谢的增强必然导致初生代谢的减弱，两者之间不断处于一种动态变化之中。植物在漫长的进化过程中形成了一种特殊的调解机制，只有在逆境到来之时才产生大量的次生代谢产物，也就是说，在逆境来临时，环境因子调控次生代谢迅速增加次生代谢产物的含量，因此次生代谢随环境的变化而变化[22]。

　　细胞学研究证据表明，高温处理金丝桃细胞10min内就可诱发金丝桃素的生物合成[23];高温处理白桦细胞2d就能使三萜成分提高35%以上[24]。药材研究证据表明，黄芩药材中的黄芩苷和黄芩素含量具有日周期变化[25];黄芩鲜根在干燥过程中含量不断增加，黄芩苷的含量增加107.8%[26];采用H2O2处理黄芩鲜根2d，活性最高的黄芩素含量提高了100%[27]。丹参的水溶性活性成分丹酚酸B在新鲜药材中含量甚微，在干燥过程中大量形成[28]，这些足以证明在短期内干预就能对植物的次生代谢产生严重影响，改变药材质量。

　　所以次生代谢产物通常是受环境所诱导，随环境的变化而变化，因此该类物质在植物体内的产生和消除是很快的。黄芩质量受环境影响较大，道地性比较明显，然而目前有对黄芩最佳采收期的研究报道近10篇，但所得出的结论差异很大，有的结论为在5～6月、有的为7～8月、有的为9月初、有的认为在10～11月，尽管各地气候条件存在差异，但这绝不是单纯的植物生长习性造成的，而是环境造成的。从以上可以看出，环境对道地药材质量的影响非常大，有什么样的环境就有什么样的药材质量。在道地产区，影响药材质量的生态因子也不是一成不变的，道地药材质量未必均优[29]，这也说明了环境对药材质量的影响。

　　2.2化学成分的多样性

　　每种植物都含有大量的次生代谢产物，现已从甘草中分离得到20余种五环三萜类化合物及300多种黄酮类化合物[30]，黄芩中也分离出40余种黄酮类化合物[31]。植物为什么包含如此多的次生代谢产物，为什么随环境的变化而变化?

　　甘草含有多种黄酮类成分，它们消除ROS的能力也不尽相同，常见的黄酮类成分有黄酮、黄酮醇、双氢黄酮、双氢黄酮醇、查耳酮、异黄酮、双氢异黄酮醇等[32]。其中甘草黄酮苷元活性大于苷类活性，查酮类化合物活性大于二氢黄酮类活性[33]。黄芩中黄酮类成分多达130余种，除上述成分外还含有二氢黄芩苷、7,2′,6′-三羟基-5-甲氧基二氢黄酮、5,7,2′,6′-四羟基二氢黄酮醇、4′,5,7-三羟基-6-甲氧基黄烷酮、2′,6′,5,7-四羟基黄烷酮、3,5,7,2′,6′-五羟基黄烷酮、5,2′,6′-三羟基-7,8-二甲氧基黄酮、3,5,7,2′,6′-五羟基黄烷酮、5,2′,6′-三羟基-7,8-二甲氧基黄酮、5,7-二羟基-6,8,2′,3′-四甲氧基黄酮、SkullcapflavoneII、5,8-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮等等[34]。

　　黄酮类化合物基本结构的生物合成的复合酶分布在内质网中，对于相对应的苷类成分来说存在亲水性糖类，很难自由渗透到磷脂双层的生物膜中，而细胞内充满大量生物膜构成的细胞器，细胞就是一个膜的系统，通过这个膜系统使某些化学成分只能存在于细胞的某一区域，因此苷类成分作用大大减弱。已经证明，当糖基被引入A环时，黄烷酮的活性消失[35]。化学成分的活性也取决于该化合物的稳定性，化学结构越稳定，它的活性也越低，大量研究证明黄酮的活性是由黄酮分子框架的酚羟基数量及位置决定的[36-38]，上述甘草和黄芩中的各种含量较低的成分均为多羟基成分，并且羟基也位于活性较高的位置。虽然含量低，但对药材的质量也不宜忽视。

　　研究显示，在逆境条件下多羟基成分含量迅速升高，苷类成分也向苷元转化，这种成分之间转化较为迅速，犹如“缓冲液”，可以迅速对外界环境作出反应，尽快使细胞内的ROS含量平衡状态，这就是植物次生代谢产物种类繁多和难以药材质量评价的根本原因。根据化学反应动力学原理，含量高的成分活性也低，有趣的是发现众多药材的多种化学成分中，含量高的成分活性较低，而活性高的成分含量又低。有人认为这些高含量低活性物质是活性成分一种贮存方式，植物一旦需要时则迅速转为高活性物质[39]。研究也显示在众多含量低但活性较高的成分具有存在着趋同变化，即一旦ROS增加，这些成分含量均显著升高。

　　3目前评价药材质量的方法

　　3.1性状评价

　　“辨状论质”是根据中药材的外观形状所表现出来的特点来判定中药材的真伪和质量优劣，是我国劳动人民长期经验总结，是中药鉴定的精髓。以药材外观性状评价质量具有悠久的历史，常常以“……为佳”、“……为良”等。中药材外观性状与药材生长的环境密切相关，而生长环境与药材质量有密切相关，所以药材的外观性状可反映出药材的生长环境。然而“辨状论质”历史经验总结，而现阶段药材来源已由野生转为栽培，药材性状更加复杂多样，栽培药材历史较短，传统的“辨状论质”并不适用于新的性状。如果采用次生代谢调控技术虽然可以大幅度提高药材的质量，但未能改变药材原有的性状，显示性状评价存在很大的局限性。

　　3.2指纹图谱

　　中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用高效液相色谱法、薄层扫描、气相色谱法和高效毛细管电泳法等色谱法以及紫外光谱法、红外光谱法、质谱法、核磁共振法和X-射线衍射法等光谱法分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。该方法可表征多种化学成分，具有专属性，在鉴别药材真伪方面具有重要意义。指纹的相似度也包含活性较低的化学成分，这些成分严重影响评价结果可靠性，因此又有模糊性，对药材质量评价意义不大。

　　3.3体外药理作用

　　这些方法采用体外实验进行，忽略了化学成分的吸收利用率，如苷类成分、人体易代谢的成分等，这种只考虑化合物本身因素的方法难以反映药材的真实质量。

　　3.4高含量单一化学成分评价

　　采用含量较高的活性成分含量作为药材质量评价标准是目前常见的做法。这种做法在某种程度上可对药材质量进行控制，然而也存在着仅仅依靠这类成分不能真实反映药材的质量，出现了很多道地药材疗效较好而指标成分含量并不高的现象，本质原因就是这种方法不能反映出药材成分复杂性。

　　4客观反映药材疗效的质量标志物(Q-Marker)选择

　　中药材成分特别复杂，各种物质含量不同、活性也不同，致使采用一种或几种含量较高的成分、或采用一类成分的总量为指标均不能反映药材的真正质量。如果将众多化学成分进行归类，把复杂的成分简单化，用不同类别能够较好反应药材质量的标志成分评价质量将更全面更完善，也就是说在目前普遍采用的含量较高的Q-Marker评价质量的基础上，再从植物众多活性较高的成分中选择新的高活性Q-Marker作为补充可更好反映药材质量[53]。

　　4.1高含量的Q-Marker防风的入血成分主要为升麻素，单体升麻素给药后在大鼠血清中只有升麻素，而且只有一个吸收峰，而含有大量升麻苷的防风提取物入血成分也是升麻素，但有2个吸收峰，且体内存留时间大大延长[54-55]，黄芩苷与黄芩素相比，血药浓度达峰时间延后，药物作用时间也大大延长[56]，其本质原因可能是苷类需要在肠道内转化为相应的苷元后才能吸收，结果最终表现为吸收缓慢而药效持久。

　　因此高含量的药材Q-Marker也是不可缺少的质量评价指标，这也一直是评价药材质量的一个重要指标。根据热力学定律，高能态的化学物质不稳定，有向低能态自发进行的趋势，因此这些含量较高的成分在植物细胞内通常都是稳定的。但是，人体内的某些酶有与植物不同，在植物体内稳定并不意味着在人体内稳定，因此化学成分在人体内稳定性也是高含量成分能否成为Q-Marker的重要前提。

　　4.2高活性的Q-Marker根据热力学原理，活性高的成分稳定性差，因此含量通常也较低。但是，该类成分不仅仅是活性高，而且多为非苷类成分，易吸收，生物利用度高，对疗效的影响也很大，因此也应该做为重要的Q-Marker。研究显示道地药材通常表现为含量较高的成分并未明显增加，而含量较低的非苷类成分增加显著。如道地产区黄芩的黄芩苷含量并不高，而黄芩素含量较高[57]，而这些苷元类成分活性很强。按质量计算黄芩中黄芩素的药效为黄芩苷的4～7倍[58-59]、防风中升麻素的药效是升麻苷的3～5倍，而这些成分是逆境胁迫的特征产物，应该作为评价道地药材的关键指标。

　　另外，药材质量与环境有密切关系，研究显示多种高活性次生代谢产物种类众多，在逆境条件下含量升高的主要是高活性成分[60]，如果将其中某一成分可作为众多成分的一个代表，可更好反映众多成分的总体水平。虽然非苷类药用成分活性高，口服吸收快而完全，但也存在着代谢迅速、药效时间短的弊病。

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　　作者：孟祥才，李晓颖，姚杰，孔玲，关瑜