流式细胞术在CAR-T细胞治疗中的应用进展

　　摘要嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcell，CAR-T)是通过基因工程技术将自体或异体T细胞改造成针对肿瘤特异性抗原的新型杀伤细胞，具有特异性强、效率高、非MHC限制等优点，在复发/难治性血液系统肿瘤和部分实体瘤中取得了良好的治疗效果。CAR-T细胞制备流程包括细胞分离和纯化、活化和分化、基因修饰、体外扩增、表型质控、保存和回输。近年来，随着流式细胞术的迅速发展，使其广泛应用于CAR-T细胞治疗的各个环节，包括治疗前筛查、体外制备和回输后监测，并在其创新优化过程中发挥着重要的作用。

　　关键词流式细胞术;CAR-T细胞;治疗前筛查;细胞制备;回输后监测

　　细胞免疫治疗是继外科手术、化疗、放疗后第4种具有显著优势及临床疗效的抗肿瘤治疗方法。作为细胞免疫治疗的重要组成部分，过继细胞治疗利用内源性的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或基因工程编码表达T细胞受体(TCR)或嵌和抗原受体(CAR)的T细胞，在肿瘤免疫治疗领域表现出显著的临床疗效和可观的研究前景。

　　医学论文投稿刊物：《免疫学杂志》由中国免疫学会和第三军医大学主办，1985年创刊，现为月刊，A4开本，内文92页，铜板纸、彩图随文印刷，国际标准连续出版物号：ISSN：1000—8861，国内统一刊号：CN51—1332/R。本刊坚持以交流学术信息、开展学术争鸣、繁荣学术园地为其办刊办刊宗旨;为本学科及相关学科读者充实理论、更新知识、积累经验服务为其目的。

　　2017年FDA相继批准Kymriah和Yescarta2种CAR-T产品上市，分别用于治疗难治/复发性(R/R)的B细胞系急性淋巴白血病(B-ALL)和弥漫大B细胞系淋巴瘤(DLBCL)，这成为细胞免疫治疗的里程碑，显示出CAR-T细胞治疗的巨大应用前景[1-2]。CAR-T细胞的制备流程包括细胞纯化和分离、活化和分化、基因修饰、体外扩增、表型质控、保存和回输。制定合理的制备方法和发展高效的检测技术是目前CAR-T细胞治疗快速发展和进入临床应用所面临的重大挑战。

　　流式细胞术(flowcytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有高效、快速、精准、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定性和定量分析技术之一[3-4]。近年来，FCM迅速发展，新技术不断突破，新仪器不断涌现，FCM基于其独特的细胞分选原理和强大的荧光标记技术，在CAR-T细胞治疗过程表现出显著的优势。

　　本文主要讨论了FCM在CAR-T细胞治疗前检查、输注后检测和各制备环节的应用与优化，以期合成安全高效的CAR-T细胞产品。治疗前检查CAR-T细胞治疗成功的关键在于准确评估患者肿瘤细胞是否表达靶抗原及靶抗原的表达量。Pan等[5]利用第二代靶向CD19的CAR-T细胞治疗42例难治/复发性(R/R)B-ALL和9例FCM-MRD+的B-ALL，要求入组病患的肿瘤细胞利用FCM检测必须有显著的CD19表达，90%的R/RB-ALL患者实现完全缓解(CR)，100%FCM-MRD+患者实现MRD-。B细胞成熟抗原(BCMA)只表达于正常和恶性浆细胞，而靶向BCMA的CAR-T细胞可用于治疗浆细胞瘤。

　　Salem等[6]利用FCM和免疫组织化学检测同时评估了43例浆细胞瘤患者肿瘤细胞表面BCMA的表达情况。结果表明，FCM检测的阳性率显著高于免疫组织化学检测(97%vs72%)(P<0.01)。同时，FCM可定量细胞表面BCMA表达量，区分正常和异常浆细胞，使其成为CAR-T细胞治疗前筛查和治疗后随访的重要工具。T细胞的获取和富集CAR-T细胞批量化生产的初始细胞群来源于病人经过血细胞分离器采集浓缩的外周血单个核细胞(PBMNC)。

　　然而，富含淋巴细胞的PBMNC也包括单核细胞、数量不等的红细胞、粒细胞和血小板[7]。仪器设备的发展促进了PBMC的有效分离，例如CliniMACSPlus细胞分选仪可富集不同T细胞亚群，如CD3+、CD4+、CD8+T细胞[8]。CD3/CD28磁珠的磁性分选也可以从PBMC浓缩物富集T细胞，还能刺激T细胞体外扩增[9]。流式细胞分选术又称荧光激活细胞分选术(fluorescenceactivatedcellsorting，FACS)，能在短时间内高效快速分选成千上万个目标细胞，目前FACS已广泛应用于T细胞的分离和富集[10]。

　　来自于CD3+T细胞亚群的CAR-T细胞被广泛应用于临床[11-12]。有研究表明，低分化阶段的干细胞记忆T细胞(Tscm)和中央记忆T细胞(Tcm)能促进CAR-T细胞在体内持续增殖和长期存活，相比于高分化阶段的效应记忆T细胞(Tem)和快速效应T细胞(Teff)表现出更强的抗肿瘤活性[13]。有一项临床试验证明了Tcm来源的靶向CD19的CAR-T细胞在治疗自体造血干细胞移植后复发的高危淋巴瘤患者中的安全性和可行性，表现出较好的临床疗效，且未观察到细胞因子释放综合症(CRS)等副反应[14]。CD62L、CCR7、CD45RA、CD45RO是CD8+T细胞不同分化阶段的表面标记，利用FCM选择性富集具有高度自我更新潜能的Tscm和Tscm亚群，可显著提高CAR-T细胞治疗的疗效[15]。

　　T细胞活化和体外扩增目前，已有多种T细胞活化策略成功应用于临床级别CAR-T细胞产品的生产，包括与天然或人造抗原呈递细胞共培养[16]、可溶性抗CD3单克隆抗体(OKT3)联合IL-2[11,17]、OKT3联合CD28抗体共刺激[12,18]、Expamer技术[19]等。最新的研究指出，在临床前肿瘤模型中，OKT3/CD28抗体磁珠刺激活化的T细胞具有相对低分化的表型，优于OKT3联合IL-2，因此广泛应用于靶向CD19的CAR-T细胞[20]。

　　FCM是分析T细胞活化和增殖的有力工具，利用特异性荧光素偶联抗体或特异性荧光探针进行复杂表型分析，评估T细胞活化、增生、效应因子的产生和转录因子的表达。Reed等[21]讨论了利用FCM评估多种外源因子对T细胞活化、增殖、细胞因子产生和转录因子表达影响的试验方法。荧光素偶联抗体既可以靶向表面抗原，也可以靶向胞内标记蛋白。特异性荧光探针可以用来分析包括增殖及细胞周期中DNA含量变化等在内的多种细胞过程。T细胞表型质控由于CAR-T细胞产品的复杂性，在应用于临床之前，必须进行严格的T细胞表型质控和放行试验使其达到明确的放行标准，包括细胞产品的特性、纯度、安全性和效能[8]。

　　细胞特性试验必须保证批量生产的细胞产品是目标亚群细胞，目前主要通过FCM分析细胞表面特异性的标记蛋白来鉴定，细胞增殖和分化能力测定也是常规应用的评估项目。多种方法可以测定细胞增殖能力，如MTT试验、ATP定量、BrdU染色、基于IP/CFSE的流式细胞术分析等，其中FCM最为方便准确[22]。细胞分化能力主要取决于T细胞的分化阶段，不同分化阶段表达特定表面标记物，如CD25、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD62L等，利用FCM测定特定分化阶段细胞比例可鉴定细胞产品的分化潜能[15]。

　　细胞纯度分析主要用来检查表达抗CAR的CD3+T细胞比例。FCM是目前临床上检测CAR-T细胞纯度的主要方法。Pan等[23]利用慢病毒转导的方法构建了SFGαCD19.4-1BB-ζ第二代CAR-T细胞，利用FCM检测表达CAR的细胞比例在50%以上。细胞安全性分析必须保证细胞产品的无菌性，同时不含内毒素和生产过程中产生的其他有害物质，另一方面还要预防转基因整合导致的基因毒性。

　　细胞效能分析主要测定细胞产品的靶生物学活性。体外实验主要测定CAR-T细胞对靶细胞的直接杀伤作用和细胞因子的分泌情况。体外细胞毒试验包括51Cr释放试验[24]、LDH试验[25]、基于重要生物靶标的FCM[26]、荧光素酶报告试验[27]以及ELISpot分析[28]等。应用FCM检测粘附肿瘤细胞系相关参数一直是个挑战。Martinez等[29]利用高通量流式细胞术探究了CAR-T细胞对多种粘附肿瘤细胞的T细胞依赖性的细胞杀伤作用，并探讨了最佳实验条件，表明高通量FCM在体外测定CAR-T细胞对实体肿瘤细胞毒作用的可行性。

　　近年来发展的流式微珠阵列技术(cytometricbeadarray，CBA)可同时测定多种细胞因子含量，相比于ELISA，CBA具有样本用量更少、检验迅速、多指标检测、操作方便、灵敏度高、重复性好、无酶-底物干扰的优势[30]。研究者曾用CBA技术实时动态监测唾液中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平，灵敏度可达0.274pg/ml[31]。输注后监测患者回输CAR-T细胞后需定期检测体内CAR-T细胞数量、细胞因子水平、患者肿瘤负荷和毒副反应，便于综合评价CAR-T细胞的治疗疗效和临床获益情况。有临床试验表明，CAR-T细胞输注后的扩增能力和存活时间是其有效杀伤肿瘤细胞的主要影响因素[32]。定位到骨髓的CAR-T细胞可扩增1000倍以上，上升趋势可维持6个月[33]。

　　监测患者外周血CAR-T细胞数量可有效预测细胞免疫治疗反应。目前，CAR-T细胞监测方法主要有FCM[34-35]、定量PCR技术[36]和示踪剂PET/SPECT成像[37]，其中FCM和定量PCR技术在临床上使用较普遍。FCM利用特异性荧光标记的抗体可以靶向胞外区分子、抗原结合域或融合蛋白，然而利用不同抗体检测的FCM容易导致结果的异致性[34]。有一项研究建立了基于荧光标记蛋白L的FACS检测CAR表达的方法，利用6种靶向不同CAR结构域的抗体，比较了人和小鼠来源CAR结构域的差异，结果表现出一致性[35]。

　　白血病患者肿瘤负荷主要定期评价骨髓细胞学和微小残留病(MRD)，淋巴瘤患者主要复查PET/CT。MRD是用来描述基于传统细胞形态学不能检测到的最小肿瘤负荷，是临床上广泛用来评价疗效和评估预后的重要指标[38]。MRD定量检测包括基于识别白血病相关异常免疫表型(LAIPs)的多色流式细胞术和检测白血病特异性IG/TR基因重排或融合基因的实时定量PCR技术(RTqPCR)[39]。虽然RT-qPCR是目前灵敏度最高的MRD检测方法，但部分白血病患者缺乏供PCR检测的遗传学标记，此时FCM是唯一选择。FCM作为一种快速便宜的MRD检测方法，应用于90%ALL患者MRD的检测，灵敏度达104[40]。

　　展望细胞治疗为现代医学和健康体系带来了革命性变化，但是将CAR-T细胞批量化生产为临床用药仍面临许多挑战，需要多学科的密切交叉合作。近年来，流式细胞仪器不断升级、流式细胞技术不断发展，使FCM的应用范围大大的扩展。流式细胞术不仅在CAR-T细胞制备的初始T细胞获取和富集、体外激活和扩增、表型质控和释放试验等多个环节进行优化，也在治疗前患者筛查和回输后体内监测、MRD检测方面也发挥着重要作用。实验技术的发展、仪器设备的改善、多学科合作将加速CAR-T细胞研发进展，使CAR-T细胞早日商品化，应用于临床。

　　参考文献

　　1PrasadV.Immunotherapy:Tisagenlecleucel-thefirstapprovedCAR-Tcelltherapy:implicationsforpayersandpolicymakers.NatRevClinOncol,2018;15(1):11-12.

　　2Noauthorslisted.FDAapprovessecondCART-celltherapy.CancerDiscov,2018;8(1):5-6.

　　3AdanA,AlizadaG,KirazY,etal.Flowcytometry:basicprinciplesandapplications.CritRevBiotechnol,2017;37(2):163-176.

　　4MckinnonKM.Flowcytometry:anoverview.CurrProtocImmunol,2018;doi:10.1002/cpim.40.

　　5PanJ,YangJF,DengBP,etal.Highefficacyandsafetyoflow-doseCD19-directedCAR-Tcelltherapyin51refractoryorrelapsedBacutelymphoblasticleukemiapatients.Leukemia,2017;31(12):2587-2593.

　　作者：李成功1,2，梅恒1,2*，胡豫1,2