姜黄素对小胶质细胞介导的神经炎症反应的抑制作用

　　摘 要：本文通过探讨在小鼠小胶质细胞(BV-2)中由TLR2介导下产生及释放的炎症因子在加入姜黄素后其释放量的变化情况，探讨姜黄素对TLR2活化引起的神经炎症及其反应的抑制作用, 为姜黄素延缓和治疗神经退行性疾病提供新的思路和理论依据。

　　关键字：姜黄素;小胶质细胞;神经炎症;TLR2

　　姜黄素(Curcumin)是一种从姜科植物例如姜黄或者天南星科植物的根茎中提取得到的黄色色素，为酸性多酚类物质，是一种天然小分子化合物[1]。通常用作肉类食品着色剂和酸碱指示剂，研究证明姜黄素具有抗炎、抗氧化等药理作用[1]。应用抗炎疗效较好的天然植物中的活性成分延缓神经退行性疾病的发展已成为该领域目前的研究热点。

　　BV-2是小鼠的小胶质细胞，是脑内中枢系统的免疫效应细胞，有免疫监视、组织修复等作用。在特定的病理条件下小胶质细胞的过度激活会分泌炎症因子，促进神经炎症的发生，引起神经损伤，导致阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等神经退行性疾病的发生[2]。

　　神经炎症反应是以小胶质细胞为介导，通过小胶质细胞过度激活，促进NO、TNF-α、等相关炎症因子产生及释放，引起神经炎症反应。小胶质细胞介导的起神经炎症反应是神经退行性疾病的重要病理特征之一。

　　TOLL样受体(TOLL like receptors)家族是模式识别受体家族，已报道的Toll样受体共有10个 (TLR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。TLR2作为其中一员，其在炎症反应发生过程的作用受到广泛关注。TLR2通过识别病原体相关的分子模式(PAMPs)，激活TLR2下游信号通路[5]。

　　TLR2信号转导途径包括两种不同的方式，一种为髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依赖型，通过MyD88诱导IBα活化并使其磷酸化降解，释放IBα所携带的核转录因子(NF-κB)中的两个亚基p50与p65，调控目的基因转录以及炎症因子的激活。另一种是髓样分化因子非依赖型(MYD88)，MYD88通过激活p38蛋白(P38 MAPK)，活化NF-κB，促进其亚基p50与p65进入细胞核，进而调控目的基因转录以及炎症因子的激活[4]。

　　血红素加氧酶1(HO-1)能够催化血红素降解为胆绿素、二价铁以及一氧化碳。HO-1及其产物具有抗炎、抗氧化作用，并对细胞具有一定的保护作用[1]。相关报道发现，HO-1通过调控促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP激酶,MAPK)信号通路发挥细胞保护和抗细胞凋亡的作用以及抑制炎症反应的发生[6]。因此HO-1作为一种诱导酶以及限速酶在生物体内发挥着重要作用。

　　近年研究发现，神经炎症反应在神经退行性病变中起到至关重要的作用。BV-2细胞的过度活化导致大量炎症因子的产生和释放，引起神经炎症反应。姜黄素作为从天然植物提取的植物化合物，已有研究证明姜黄素具有抗炎、抗氧化等药理作用，但对其抗神经炎症作用及中枢神经系统的保护作用及其机制的研究仍不充分。因此本文通过Pam3CSK4刺激诱导小胶质细胞活化模拟中枢神经系统内神经炎症反应的模型，探究姜黄素对神经炎症的抑制作用及其机制，为姜黄素与神经炎症相关性退行性疾病的治疗与开发提供理论依据。

　　BV-2细胞购于美国模式培养物集存库(ATCC)，由深圳大学医学院保存。使用完全培养基(内含10%胎牛血清、1%双抗)，2d传代，传代细胞密度为5×105。

　　MTT法检测BV-2细胞活性

　　BV-2细胞接种每孔4×105个细胞的密度于12孔板，每孔1mL。将细胞分为正常组、姜黄素+Pam3CSK4组和姜黄素组，每组设2个平行孔。细胞孵育24h后加入浓度梯度(5、10、20 M)的姜黄素，孵育1h，再加入相同剂量(0.1g/mL)的Pam3CSK4刺激。孵育24小时后每孔加入MTT(5 mg/mL)10μL，培养箱孵育4-6h，吸净上清，每孔加入DMSO液300μL，用酶标仪在570nm处检测吸光度，计算细胞活性。

　　Griess法检测NO含量

　　BV-2细胞接种每孔4×105个细胞的密度于24孔板，每孔500μL，待细胞贴壁后，分为正常组、姜黄素组和加入姜黄素和Pam3CSK4(0.1 g/mL)刺激组，每组设2个平行孔，加入浓度梯度(5、10、20μM)的姜黄素后，给予Pam3CSK4刺激，24h收集细胞培养液上清100μL至96孔板，再加入1:1混合均匀的100μL Griess检测液A、B，震荡混匀液体，用酶标仪在540nm处检测吸光度，计算NO含量。

　　ELISA检测TNF-α、PGE2含量

　　根据Griess法检测NO含量的检测结果，将其中的培养液上清液收集完全，500rpm/min，离心5min，使用ELISA双抗夹心法检测。

　　RT-qPCR法和Western Blot法测定HO-1

　　同样的细胞培养方法，进行RT-qPCR检测：

　　进行总RNA的提取：

　　从培养皿里收集细胞，尽量弃去培养基，每孔加入300μL Buffer R-Ⅰ，移液枪吹打8-10次。

　　转移上述细胞悬浮液到1.5mL离心管中，用装有21-25号枪头的注射器反复抽吸8-10次。

　　加110μL Buffer R-Ⅱ，涡旋振荡15-30s，12000g离心5min。

　　取上清至1.5mL离心管中，加200μL异丙醇，混合均匀。

　　将制备管置于2mL离心管中，将混合液转移至备置管中，6000g离心1min。

　　弃滤液，于制备管中加500μL Buffer W1A，12000g离心1min。

　　弃滤液，于制备管中加700μL Buffer W2，12000g离心1min，以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次。

　　弃滤液，，将制备管置回到2mL离心管中，12000g离心1min。

　　将制备管放入干净的1.5mL离心管中，加入70-100μL Buffer TE，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱得RNA。

　　RNA逆转录成cDNA

　　RNA定量：

　　使用超纯水作为本底，取2μL RNA至RNA定量黑板检测孔中进行检测，根据检测的数据可得RNA的浓度。

　　计算逆转录需要加入的RNA体积：X μL=1000ng/(测得浓度)ng/μL

　　同样的细胞培养方法，进行蛋白免疫印迹法检测

　　细胞总蛋白的提取：

　　细胞培养板中加入60-100μL裂解液，将细胞收集至1.5mL离心管中。12000rpm，5min，4℃，收集上清即为总蛋白，-20℃冻存。

　　蛋白浓度的测定：

　　分别取10μL样品和BSA蛋白标准品加入到96孔板。每孔加入100μL BCA检测液。37℃避光孵育30min。使用分光光度计测定562 nm处的吸光值。通过标准曲线计算相应的样品蛋白浓度。

　　提取的总蛋白上清中加入4×上样缓冲液，沸水浴5min，-20℃冻存。

　　蛋白印迹分析：

　　配置浓度为10%的分离胶，加入TEMED后应充分混匀，注入玻璃板间隙，并在顶层加入适量的异丙醇，室温放置至分离胶凝固，用超纯水冲洗凝胶上部数次，配置浓缩胶，插入样品梳，垂直放置至浓缩胶凝固。

　　待蛋白凝胶配置结束后，根据计算所得的样品蛋白浓度加入样品，开始电泳，电压为90V。电泳完成后，裁剪蛋白凝胶。在转移缓冲液里放入裁好的胶、浸过乙醇的PVDF膜和滤纸。依次在半干转印仪上叠放7张浸泡过转移缓冲液的滤纸、PVDF膜，胶和另外7张浸泡过缓冲液的滤纸，盖上转膜装置盒，接通电流，1.3A，18min。

　　将PVDF膜移至封闭液中，室温摇动1h。孵上一抗，4℃过夜。TBST室温洗膜洗4次，每次5min。加入二抗，室温孵育1h，用TBST室温洗膜3次，每次10min。

　　将1：1配置的ECL显影液A和ECL显影液B覆盖在蛋白面的PVDF膜上，转移到显影盘中，放入超灵敏多功能成像仪中进行显影。

　　通过MTT法检测，单独加入5、10、20 μM的姜黄素以及同时加入0.1μg/mg的Pam3CSK4刺激24h后，与正常组相比，实验组细胞活性没有明显变化。说明在该浓度范围内，姜黄素对小神经胶质细胞的细胞活性没有任何影响，因此选定该范围内的姜黄素进行下一步实验。

　　Griess法测定的实验结果如图3，结果显示，与正常组相比，加入Pam3CSK4刺激的BV-2细胞中NO的释放量增加(P<0.05)，说明Pam3CSK4能够刺激激活BV-2细胞中并产生炎症反应。但在加入5、10、20μM的姜黄素后，BV-2细胞内的NO释放量随着姜黄素的浓度的增加有明显降低(P<0.05)，说明姜黄素对Pam3CSK4诱导BV-2细胞炎症因子NO释放具有抑制作用。

　　与正常组相比，在加入Pam3CSK4的刺激的BV-2细胞中，炎症因子TNF-α和PGE₂的释放量增加，说明Pam3CSK4可以促进炎症因子的释放，但是在加入了不同浓度(5、10、20μM)的姜黄素后， BV-2细胞内的的炎症因子TNF-α和PGE₂的释放量被明显抑制，且随着姜黄素浓度的增加呈现递减趋势(P<0.05)，说明姜黄素对的Pam3CSK4诱导引起的炎症因子TNF-α和PGE₂的释放具有抑制作用。

　　小胶质细胞加入姜黄素后抑制了由TLR2激动剂Pam3CSK4引起的NF-κB信号通路的活化以及核转位，且呈现出浓度依赖性。说明姜黄素可以通过抑制NF-κB信号通路的活化和核转位，发挥对炎性因子的抑制作用。

　　有研究表明，HO-1作为抗炎抗氧化的诱导酶，具有保护细胞的作用。因此，为了验证姜黄素对Pam3CSK4诱导引起的神经炎症的抑制作用是否与HO-1有关，在细胞中加入不同浓度的姜黄素。结果表明，不同浓度的姜黄素(5、10、20μM)可以促进HO-1的mRNA和蛋白的表达，并呈现出浓度依赖性。

　　讨 论

　　1.神经退行性疾病与小胶质细胞的激活

　　中枢神经系统内的炎症反应在神经退行性疾病中起着重要的作用，在特定的病理条件下小胶质细胞的过度活化，释放NO、TNF-α、PGE2等炎症因子，诱导氧化应激反应，促进神经元凋亡级联反应，引起神经退行性疾病的发生。小胶质细胞的活化和炎性因子的释放均为神经炎症反应的特征。因此研究药物对小胶质细胞的过度活化的抑制作用及其机制，将成为有效防治神经退行性疾病的重要思路之一，为相关的药物开发提供了新思路。

　　2.姜黄素对Pam3CSK4刺激BV2细胞产生及释放的NO、TNF-α以及PGE2的抑制作用

　　在炎症因子刺激作用下，由巨噬细胞、胶质细胞等释放大量的 NO，NO 是造成神经细胞损伤死亡的重要炎症因子，高浓度的 NO 通过抑制或激活相关信号通路发挥细胞毒性作用。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一个多向性的先导感染细胞因子，可以通过激活下游的信号路径调节炎症的发生[8]，前列腺素E2(PGE2)是花生四烯酸经过环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)催化后的主要代谢产物[9]，能够引起的炎症因子的发生。本研究发现姜黄素可呈剂量依赖性的明显降低Pam3CSK4诱导的BV-2细胞的NO、 TNF-α以及PGE2释放量，从而抑制炎症反应，保护神经元细胞，这可能是姜黄素发挥抗炎作用，延缓神经退行性疾病的机制之一。

　　3.姜黄素对NF-κB的抑制作用

　　由Pam3CSK4刺激小胶质细胞所建立的炎症模型发现，TLR2的活化可引起NF-B信号通路的活化，调控炎症基因的表达，促进炎症因子及细胞因子的产生及释放。而姜黄素可通过抑制NF-κB的核转位[10]，进而抑制由小胶质细胞过度激活所引起的炎症因子的释放，抑制由TLR2活化引起的炎症反应。

　　4.姜黄素对HO-1蛋白表达的促进作用

　　HO-1在小胶质细胞中具有神经保护和抗细胞凋亡的作用。姜黄素呈剂量依赖性诱导HO-1的mRNA和蛋白的表达，激活HO-1信号通路将小胶质细胞恢复到其静止失活状态。通过姜黄素上调HO-1可抑制由TLR2激动剂Pam3CSK4诱导的炎症因子的释放。

　　医学论文投稿期刊：《免疫学杂志》由中国免疫学会和第三军医大学主办，1985年创刊，现为月刊，A4开本，内文92页，铜板纸、彩图随文印刷，国际标准连续出版物号：ISSN：1000—8861，国内统一刊号：CN51—1332/R。

　　结论

　　由于NO、TNF-α、PGE2等炎症因子过度激活和释放使得脑内中枢系统产生炎症反应，从而对神经系统造成损伤，进而引起神经退行性疾病。有研究证明，姜黄素具有抗炎、抗氧化等药理作用，通过本研究验证姜黄素的抗神经炎症作用。

　　用TLR2的配体Pam3CSK4刺激小胶质细胞，加入不同浓度的姜黄素，应用MTT法得到姜黄素对小胶质细胞没有毒性作用的浓度范围。该浓度范围的姜黄素通过抑制NF-κB的核转位，抑制NF-κB下游信号通路中NO、TNF-α、PGE₂等炎症因子的产生及释放。另外,姜黄素可通过诱导HO-1的表达抑制由TLR2激动剂Pam3CSK4诱导的炎症因子的产生及释放。综上所述，本研究结果表明姜黄素可以有效抑制TLR2活化引起的神经炎症反应。

　　参考文献：

　　[1]朱子夫.HO-1抗氧化损伤研究进展[J]医学综述,2010,16(15)

　　[2] 邱远,丁艳,徐文岳.TLR2和TLR4的TLR_IL_1receptor结构与功能 [J]免疫学杂志,2014,30(2)

　　[3] 杨娟.TLR2介导的小鼠小胶质细胞抗HCV免疫应答初探[D]甘肃：宁夏医科大学研究生学院.2011

　　[4]赫天一,王泽,陆宇燕,刘宏鑫.Toll样受体2的研究进展[N]沈阳师范大学学报,2013-01

　　[5] 常晓彤,辇晓峰,王振辉.Toll 样受体信号转导途径研究进展[R] 河北：河北北方学院生物化学教研室,2011

　　[6] 吴建良,沈敏敏,杨水新,王 翔,马增春.阿魏酸对小胶质细胞炎性反应的抑制作用[N] 中国药理学通报,2015-01

　　[7] 黄丰,邓华明 ,朱苗苗,肖飞,杨丽,张在军,肖瑛,聂红. 阿魏酸对脂多糖诱导的小鼠小胶质细胞炎性反应的抑制作用[J]动物学研究,2011,32(3)

　　作者：杨家琪