新资源食品川麦冬须根提取物的质量标准研究

　　摘 要：采用薄层色谱(thin layer chromatography，TLC)法对样品中的甲基麦冬黄烷酮 A 进行定性鉴别以示区别山麦冬;参照 2020 版《中国药典》附录相关方法，测定样品中总灰分、干燥失重和重金属;参照《食品安全国家标准》相关方法，测定样品中菌落总数、霉菌和酵母菌数、大肠菌群和沙门氏菌;采用紫外 -可见分光光度(ultraviolet and visible spectrophotometry，UV)法测定样品中总皂苷和总黄酮含量;采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法测定样品中麦冬皂苷 D 含量。结果表明，薄层色谱中供试品与对照品在相同位置显相同颜色的荧光斑点。总灰分为 0.695% ～ 0.857%，干燥失重为 8.074% ～9.013%，铜含量为 15.024 ～ 16.037mg/kg，铅含量为 0.728 ～ 0.826mg/kg，砷含量为 0.662 ～ 0.815mg/kg，汞含量为 0.073 ～ 0.087mg/kg，镉含量为 0.166 ～ 0.182mg/kg;菌落总数均小于 103 CFU/g，霉菌和酵母菌数均小于 102 CFU/g，未检出大肠杆菌和沙门氏菌;总黄酮含量为 9.17 ～ 10.12mg/kg，总皂苷含量为 31.70 ～32.99mg/kg;麦冬皂苷 D 含量为 0.287 ～ 0.308mg/kg。质量标准检测方法可控性高、可操作性和专属性强，可为于川麦冬须根提取物的质量控制提供理论基础。

　　关键词：川麦冬须根;提取物;薄层色谱法;高效液相色谱法;质量标准

　　麦 冬 为 百 合 科 植 物 麦 冬(Ophiopohonjaponicus(L.f)Ker-GawL.)的干燥块根，为临床常用中药，具有养阴生津、润肺清心功效，用于治疗肺燥干咳、阴虚劳嗽、喉痹咽痛、内热消渴等症[1]。麦冬化学成分主要为甾体皂苷类、高异黄酮类和多糖类等成分，其中前两者是麦冬的主要活性部位[2-3]，具有降血糖、保护心血管系统、增强免疫、抗炎、抗肿瘤、延缓皮肤衰老等作用[4-10]。四川省三台县和浙江杭州笕桥一带分别作为川麦冬和浙麦冬的道地产区，其中以川麦冬产量最大。大量研究表明，麦冬须根活性成分、药理作用与块根相似，总皂苷和多糖含量高于块根[11-14]，传统加工过程中麦冬须根的弃用造成了极大资源浪费。2019 年 4 月，四川省发布了《麦冬须根食品安全地方标准》[15]，正式将川麦冬须根列为新资源食品，在大健康理念的背景下，麦冬须根在药食同源、保健食品方面显示出极大的开发价值及应用前景。

　　当前，有关川麦冬须根提取物的质量标准尚未见相关报道，研究拟在研制出川麦冬须根提取物的基础上[16-17]，对其进行规范化的质量标准研究，以期为川麦冬须根提取物产业化有效控制质量提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与材料

　　川麦冬及其须根采收于四川省三台县花园镇麦冬种植基地，经四川中医药高等专科学校金虹教授鉴定为百合科植物麦冬(Ophiopogonjaponicus(L.f.)Ker-Gawl.)及其须根。川麦冬须根提取物为须根经水和乙醇提取、浓缩和纯化、精制加工制成的黄棕色粉末。芦丁(纯度≥ 98%)、鲁斯可皂苷元(纯度≥ 98%)、山麦冬药材：中国食品药品检定研究院;甲基麦冬黄烷酮 A(纯度≥ 98%)、麦冬皂苷 D(纯度≥ 98%)：成都曼思特生物科技有限公司;乙腈(色谱纯)：国药集团化学试剂有限公司;三氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、高氯酸(分析纯)：成都科隆化学品有限公司;水为超纯水。

　　1.2 仪器与设备

　　LC1525 型高效液相色谱仪(配有蒸发光检测器及 Labsolutions 工作站)：美国 Waters 公司;UV-1100 型紫外 - 可见分光光度计：中国上海天美科技有限公司;BP121S 型电子分析天平：北京 Sartorius 天平有限公司;SB-3200DTDN 型超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份有限公司;W202B 型数控恒温浴锅：上海申胜生物技术有限公司;BPH-9042 恒温培养箱：上海仪天科学仪器有限公司;LB-JL2 菌落计数器：青岛路博伟业环保科技有限公司。

　　1.3 试验方法

　　1.3.1 薄层色谱鉴别称取川麦冬须根提取物 0.5g，加三氯甲烷 -甲醇(7∶3)混合溶液 20mL，超声 30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷 0.5mL 使溶解，作为供试品溶液。分别称取麦冬、山麦冬粉末各 2g，加三氯甲烷 - 甲醇(7∶3)混合溶液20mL，浸泡 3h，超声 30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷 0.5mL 使溶解，作为对照药材溶液。取甲基麦冬黄烷酮 A 对照品，加三氯甲烷制成 1mg/mL 的溶液，作为对照品溶液。按 2020 年版《中国药典》(四部)通则 0502法[18]进行试验：吸取麦冬供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各 6μL，分别点于同一硅胶GF254 预制板上，以石油醚(60 ～ 90℃)- 乙酸乙酯(8∶2，V/V)为展开剂，上行展开，展距为8cm。取出，晾干，置紫外光灯(波长 254nm)下检视。

　　1.3.2 质量标准测定

　　1.3.2.1 总灰分、干燥失重、微生物限度测定按照《中国药典》2020 版四部通则 2302 法[18]和 0831 法[18]分别测定样品中总灰分和干燥失重，每批样品平行测定 2 次，取平均值。按照 GB 4789.2《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[19]规定的方法进行测定菌落总数;按照 GB 4789.5《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》[20]规定的方法进行测定霉菌和酵母菌总数;按照 GB4789.3《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[21]规定的方法进行测定大肠菌群;按照 GB4789.4《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》[22]规定的方法进行测定沙门氏菌。

　　1.3.2.2 重金属测定按照《中国药典》2020 版四部通则 2321 法[18]分别进行铜、铅、砷、汞和镉的含量测定，每批样品平行测定 2 次，取平均值。

　　1.3.3 总黄酮含量测定称取约 100mg 川麦冬须根提取物(精确至0.1mg)，置于容量瓶中，加蒸馏水，超声溶解，定容至 25mL，摇匀，精密吸取储备液 5mL，加水定容至 25mL，得供试品溶液。精密称取芦丁对照品适量，置于 25mL 容量瓶中，加 5mL 甲醇溶解，用蒸馏水定容至 25mL，制成浓度为250μg/mL 的对照品溶液。分别吸取对照品和供试品溶液各 4mL 置于25mL 容 量 瓶 中， 加 入 30% 的乙醇溶液 8mL，加入 5% 的亚硝酸钠溶液 0.7mL，摇匀，放置5min，加入 10% 硝酸铝溶液 0.7mL，5min 后加入 1mol/L 的氢氧化钠 5mL，摇匀，用 30% 的乙醇溶液定容，放置 10min。以同批次试剂为空白，按照紫外 - 可见分光光度法(通则 0401)[18]，在 493nm 处测定吸光度。

　　1.3.4 总皂苷含量测定取本品粉末 0.1g，置 100mL 容量瓶中，加甲醇 70mL，超声处理(功率 500W，频率 40kHz)5min，冷却，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取鲁斯可皂苷元对照品适量，精密量取，加甲醇制成 50μg/mL 的对照品溶液。精密量取对照品溶液 0.5、1、2、3、4、5、6mL，分别置具塞试管中，于水浴中挥干溶剂，精密加入高氯酸 10mL，摇匀，置热水中保温15min，取出，冰水冷却，以相应的试剂为空白，参照紫外 - 可见分光光度法(通则 0401)[18]，在 397nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。精密量取供试品溶液 3mL，置 10mL 具塞试管中，按照标准曲线的制备方法，自“于水浴中挥干溶剂”起，依法测定吸光度，从标准曲线计算得出样品中总皂苷含量。

　　1.3.5 麦冬皂苷 D 含量测定

　　1.3.5.1 供试品溶液的制备 称取约 100mg 川麦冬须根提取物(精确至 0.1mg)，置于容量瓶中，加蒸馏水，超声溶解，定容至 25mL，摇匀，精密吸取储备液 5mL，加水定容至 25mL，即得。

　　1.3.5.2 对照品溶液的制备 精密称取麦冬皂苷 D 对照品适量，置于 25mL 容量瓶中，加甲醇5mL 溶解，用蒸馏水定容，制成浓度为 520μg/mL的对照品液，摇匀，即得。

　　1.3.5.3 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Alltima C18(250×4.6mm，5μm); 流 动 相∶乙 腈 - 水(52∶48，V/V); 柱 温：30 ℃;流速：1.0mL/min;漂移管温度：65℃ ;气体流速：2.5mL/min;进样量：20μL。分别取供试品溶液和对照品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。

　　1.3.5.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.4、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别置10mL 容量瓶中，加甲醇定容。按“1.3.5.3”项下色谱条件测定，以对照品质量浓度 X(μg/mL)为横坐标、峰面积 Y 为纵坐标进行线性回归。

　　1.3.5.5 定量限与检测限考察 按 2020 年 版《中国药典》(二部)中关于检测限与定量下限的要求，将麦冬皂苷 D 自标准曲线最低浓度20.8μg/mL 向下逐级稀释，按“1.3.5.3”项下色谱条件进样分析。结果麦冬皂苷 D 的检测限(信噪比为 3)为 0.04μg/mL，定量下限为 0.1μg/mL，可满足样品测定灵敏度要求。

　　1.3.5.6 精密度试验 取麦冬皂苷 D 对照品溶液，按“1.3.5.3”项下色谱条件重复进样 6 次，记录峰面积。

　　1.3.5.7 稳定性试验 取川麦冬须根提取物约100mg，精密称定，按“1.3.5.1”项下方法制备供试品溶液后，分别在室温下放置 0、2、4、6、12、24h，按“1.3.5.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。

　　1.3.5.8 重复性试验 取川麦冬须根提取物 6 份，每份约 100mg，按“1.3.5.1”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.5.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按回归方程计算含量。

　　1.3.5.9 加样回收率试验 取川麦冬须根提取物 6 份，每份约 50mg，精密称定，每份中精密加入与样品中含量等量的麦冬皂苷 D 对照品，按“1.3.5.1”项下方法制备供试品溶液，然后按“1.3.5.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算其回收率。

　　1.3.5.10 样品测定 分别取各批次样品 100mg，精密称定，按“1.3.5.1”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.5.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按标准曲线法计算含量，每批样品重复测定 2 次。

　　2 结果与分析

　　2.1 薄层色谱鉴别麦冬药材、川麦冬须根提取物均与对照品色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰，Rf 为 0.65，而山麦冬药材无相应荧光斑点。

　　2.2 总灰分、干燥失重、微生物限度测定检 测 结 果 显 示， 所 测 10 批样品总灰分为 0.695% ～ 0.857%，干燥失重为 8.074% ～9.013%;菌落总数每克均少于 1000 个，霉菌和酵母菌数每克均少于 100 个，大肠杆菌、沙门氏菌均未检出，所测样品均符合《中国药典》2020 版及《食品安全国家标准》的相关规定。建议以平均值上浮约 20% 暂定川麦冬须根提取物总灰分不得超过 1%，干燥失重不得超过 11%。

　　2.3 重金属测定测定结果显示，铜含量为 15.024 ～ 16.037mg/kg，铅含量为 0.728 ～ 0.826mg/kg，砷含量为 0.662 ～ 0.815mg/kg，汞含量为 0.073 ～ 0.087mg/kg，镉含量为 0.166 ～ 0.182mg/kg。所测样品均符合《中国药典》2020 版及《食品安全国家标准》的相关规定，结果见表 2。建议以平均值上浮约 20% 暂定铜不得超过 20mg/kg，铅不得超过1mg/kg，砷不得超过 1mg/kg，汞不得超过 0.1mg/kg，镉不得超过 0.2mg/kg。

　　2.4 总黄酮、总皂苷含量测定测定结果显示，总黄酮含量为 9.17 ～ 10.12mg/kg，总皂苷含量为 31.70 ～ 32.99mg/kg，结果见表 3。建议以最低值下浮约 20% 暂定总黄酮不得低于 8mg/kg，总皂苷不得低于 30mg/kg。

　　2.5 麦冬皂苷 D 含量测定

　　2.5.1 色谱条件与系统适用性试验色谱图。结果显示，样品中麦冬皂苷 D的保留时间约为 6.9min，与其余色谱峰的分离度均大于 1.5，理论板数以麦冬皂苷 D 计大于 6000。

　　2.5.2 线性关系考察麦冬皂苷 D 得回归方程为 Y=1.7824X+1.573(r=0.9993)，表明麦冬皂苷 D 质量浓度在 20.8 ～520μg/mL 范围内线性关系良好。

　　2.5.3 精密度、稳定性、重复性、加样回收率考察精密度试验结果：麦冬皂苷 D 峰面积的 RSD为 0.67%(n=6)，表明仪器精密度良好;稳定性试验结果：样品中麦冬皂苷 D 峰面积的 RSD 为1.01%(n=6)，表明样品溶液在室温下放置 24h内稳定;重复性试验结果：样品中麦冬皂苷 D 的平均含量为 0.308%，RSD 为 1.73%(n=6)， 表明该方法重复性良好。加样回收率结果：麦冬皂苷 D 的平均回收率为 101.584%，RSD 为 2.03%(n=6)，表明方法准确度良好。

　　3 结论

　　麦冬指标性成分主要为甾体皂苷类和高异黄酮类，而麦冬皂苷 D 作为其主要甾体皂苷之一，与麦冬最新研究报道的功效密切相关，故将总皂苷、总黄酮和麦冬皂苷 D 含量共同作为质量控制指标，与 2020 版《中国药典》中麦冬以单一总皂苷含量作为质量控制指标相比更为全面，具有较大提升。薄层色谱试验证实了山麦冬属植物不含或很少含沿阶草属植物麦冬的特征性成分(高异黄酮类化合物)，同时可对山麦冬须根提取物等代用品、混淆品进行有效鉴别，保证川麦冬须根原料来源。皂苷类成分极性较大，结构复杂，无紫外吸收，并且其测定经常受麦冬多糖的干扰，采用紫外检测方法，灵敏度低且有干扰峰，不易测定，故采用蒸发光散射检测器(ELSD)，利用 HPLC法测定。

　　基于充分的化学研究和定性、定量分析，首次建立的川麦冬须根提取物的质量控制方法和标准，涉及薄层色谱鉴别、检查(总灰分和干燥失重)，总黄酮和总皂苷的 UV 含量测定，以麦冬皂苷 D 为指标成分的 HPLC 含量测定。川麦冬须根提取物的质量控制方法和标准，通过了第三方(绵阳市食品药品检验所)的复核验证，3 批送检样品含量测定结果在单位之间的 RSD 在 3. 16%以下，表明本研究的检测方法准确方便，重复性好，标准可行，可为于川麦冬须根提取物的质量控制提供理论基础。

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　　作者：何礼 1，金虹 1，*，汤丹丹 1，郭涛 2，黄毅 3，田仁君 1