不同氮素对根结线虫及土壤微生物的影响

　　摘要 为筛选根结线虫控制技术，采用传统平板法和 BiologECO 生态板评价了液氨、氨水和碳酸氢铵3种 氮素 对根结线虫及土壤微生物的影响。结果表明，等氮条件下液氨处理杀线虫效果最好且黄瓜产量最高，氨水次之。液氨用量在375.0kg/hm2 的条件下，对黄瓜根结线虫的防效达到71%，和10%噻唑膦颗粒剂(GF)45.0kg/hm2 处理相比效果没有显著差异(79.9%)。种 植前，细 菌 数 量、AWCD 值、Shannon指 数、McIntosh指 数和 Simpson指 数均 随着液氨用量的增加而减少，随着氨水和碳酸氢铵用量的增加而增加;但所有处理均显著降低了土壤真菌的数量。黄瓜收获后，土壤细菌数量、真菌数量、AWCD值、Shannon指数、McIntosh指数和 Simpson指数均随着氮素用量的增加而提高，且高于空白处理和10%噻唑膦 GF45.0kg/hm2 处理。以上结 果 说 明，液 氨、氨水和碳酸氢铵不但可以作为土壤肥料，也可以作为一种高效、低价和生态化的根结线虫防治剂进行推广应用。

　　关键词 液氨; 氨水; 碳酸氢铵; 土壤消毒

　　根结线虫 Meloidogynespp.是一种较为严重的土传病害，寄主范围很广，可以危害瓜类、茄果类、胡萝卜、白菜等几十种蔬菜，常常会造成作物的大面积减产，给农业生产造成巨大损失[1]。据统计，全世界由根结线虫造成的农作物损失高达10 亿美元[2-3]。目前，我国蔬菜根结线虫病呈逐年加重趋势，已成为蔬菜生产上的重要病害，我国很多地方都有根结线虫病严重发生和危害的报道[4]。

　　土壤化学熏蒸消毒是防治根结线虫病等土传病虫害最有效、最直接 的 手 段 之 一，在 国 内 外 广 泛 应用。目前，在 我 国 登 记 的 熏 蒸 剂 有 5 种，氯 化 苦(chloropicrin)、棉隆(dazomet)、威 百亩(metham-so-dium)、硫酰氟(sulfurylfluoride)和 辣 根 素(isothio-cyanates)，其中氯 化 苦、棉 隆 和 威 百 亩 是 应 用 最 广泛的3种药 剂[5]。

　　但目前 应 用 这 些 消 毒 剂 的 价 格偏高 且 生 态 破 坏 性 大，限 制 了 其 大 面 积 应 用 和推广。氨是作物的重要无机养分，也是效力很强的杀菌剂，相对于化学熏蒸剂价格更加便宜。液氨，作为含氮量最高的氮肥，不但是很好的化学肥料，也有很好的杀菌效果，可以有效防治棉花 枯 萎 病 菌 Fusariumoxysporum 和黄萎 病 菌Verticillium dahliae，小麦全蚀病菌 Gaeumnnomycesgraminis 以及土 壤 中 大量的杂草种子[6-8]。

　　氨水可以有效杀灭小麦冠腐病病原菌粉红镰刀菌F.roseum，抑制土壤中腐皮镰刀菌F.solani孢子的萌发，减少土壤中香蕉枯萎病菌F.oxysporum 的数量 等[9-11]。碳酸氢 铵 能 够 有 效抑制瓜类枯萎病菌F.oxysporum[12-13]，马铃薯银屑病、白菜根 肿 病 等[14-15]。也有研 究 报 道，碳 酸 氢 铵可以防治南 方 根 结 线 虫 Meloidogyneincognita，氨水可以防治茶苗根结线虫 M.incognita[16-17]。但目前对这3种氮源物质(液氨、氨水和碳酸氢 铵)对 土壤中根结线虫的防治效果以及土壤微生物生态变化的研究偏少。本研究在温室条 件 下，评 价3种 氮 素(液 氨、氨水和碳酸氢铵)对根结线虫病害的防治效果，以及对土壤功能微生物数量和群落变化 的 影 响，为 根 结 线虫病害的防治寻找一种低成本、生 态 化 的 有 效 控 制技术。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验地概况

　　试验地点位于北京市大兴区庞各庄镇惠友农庄温室基地，试验温室根结线虫病害较为严重。土 壤理化性质如下：全氮1.27g/kg，有效磷193mg/kg，速效 钾 614 mg/kg，铵 态 氮 8.73 mg/kg，硝 态 氮30.9mg/kg，有 机质 34.5g/kg，EC 值 18.3 m/S，pH8.0。黄瓜品种为‘京研夏美2号’。

　　1.2 试验设计和处理方法

　　试验共11个处理，将根结线虫病害严重的设施土壤翻耕至25cm 深，土壤含水量30%以下时，进 行 不 同 消 毒 处 理 试 验。 不同剂量的液氨(150.0、262.5kg/hm2 和375.0kg/hm2)消毒处理：本 试 验 所 使 用 的 液 氨 为 高 纯 液 氨 (纯 度 大 于82.3%;储存钢瓶：高度95cm，半径13cm)，由济南德源气体有限公司生产。采用分布带覆盖的方法施用液氨。在设施土壤中挖若干个坑，每个坑中埋上一端打一个死结的具有小孔的分布带，每两个分布带的间距为150cm，分布带上面覆盖塑料薄膜，薄膜四周用土埋实;通过分布带将液氨施于设施土壤中，液氨消毒7d后，揭开塑料薄膜晾干7d，然后进行常规田间管理。不同剂量的氨水(678.0、1186.5kg/hm2 和1695.0kg/hm2)消毒处理：本试验所使用的氨水由济南顺阳化工科技有限公司生产(氨含量18.2%)。

　　采用浅埋滴灌的方法施用，将滴灌管埋于翻耕后的土壤下面5cm深处，滴灌管的间距为40cm，滴灌管埋好后，在土壤上面覆盖塑料薄膜，塑料薄膜四周用土埋实，在塑料薄膜四周浇水防止漏药;将氨水储存在储水池中，密闭防止氨气逸出;连接储水池和滴灌管道，通过水泵将氨水从储水池输送到滴灌管中;氨水输送完成后，储水池加入清水，清洗滴灌管道;关闭阀门，全部密闭，进行氨水消毒。

　　氨水消毒7d后，即可揭开塑料薄膜;揭膜后，将浅埋的滴灌管抽出，土壤自然晾干7d，进 行 常 规 田 间 管 理。不同剂量的碳酸氢铵(726.0、1270.5kg/hm2 和1815.0kg/hm2)消毒处理：本试验所使用的碳酸氢铵由天津渤化永利化工股份有限公司生产(氨含量17.0%)，将不同剂量的碳酸氢铵均匀撒在土壤表面，然后均匀翻入土壤中，覆膜消毒7d，揭开塑料薄膜晾干7d，然后进行常规田间管理。以 杀 线 虫 剂10%噻 唑膦 GF(日 本 石 原产业株式会社 研 发)处 理(2g/株，45.0kg/hm2)为化学药剂对照，移栽时将药剂施于黄瓜苗根部以下。另设空白对照处理。化学对照处理和空白对照处理在土壤翻耕后进行覆膜处理，覆膜7d后，揭开塑料薄膜晾干7d，然后进行常规田间管理。每个处理小区12m2，重复3次，共33个小区，随机排列。土壤处理 时 间 为 2018 年 8 月 15 日，黄瓜定植时间是2018年9月1日。

　　1.3 根结线虫病情调查在黄瓜定植前未进行氮肥消毒时(2018年9月1日)和黄瓜收获后(2018年12月10日)，采用随机五点取样法，分别从各个小区取土样1kg左右，采用贝曼漏斗法(托盘法)分离土壤中的线虫并进行镜检，测定土壤中根结线虫的数量变化[18]。试验结束后，每个小区采取5株黄瓜根，调查根结数量，计算根结指数和防治效果。黄瓜收获期，连续统计每个处理的黄瓜产量。根结线虫危 害 程 度 分 级 标 准：0级，无 根 结，根系健康;1 级，仅 有 少 量 根 结，占 全 根 系 的 11% 以下;3级，根结明 显，占 全 根 系 的11%～25%;5级，根结特别明显，占 全 根 系 的26%～50%;7级，根 结数量很多，占全 根 系 的51%～75%;9级，根 结数 量特多，占全根系的75%以上[19]。

　　1.4 土壤可培养微生物分析对黄瓜定植前和收获后采集的土壤样品进行可培养微生物分析。采用稀释平板法测定不同处理土壤中细菌、放线菌和真菌的数量。真菌采用 PDA 培养基，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌采用改良高氏1号培养基[20]。

　　1.5 土壤微生物群落水平生理特征的测定(com-munitylevelphysiologicalprofiling，CLPP)

　　对 黄瓜 定 植 前 和 收 获 后 采 集 的 土 壤 样 品 通 过BiologECO 生 态 板 (BiologInc.，Hayward CA，USA)进行微生物对碳源利用情况的测定。BiologTMECO生态板共包括31种不同碳源，每个碳源有3个重复。将采集的土壤样品10g加 入 到90mL 灭 菌的氯化钠溶液中(8.5g/L NaCl)摇动30min，然后进行梯度稀释到10-3。将150μL稀释液慢慢加入到BiologECO 生态板的96孔中。生态板在25℃黑暗条件下培养240h。前72h的培养时间段每12h检测吸光度，72h后每24h检测吸光度。吸光度用酶标仪在590nm 波长下进行测定(Bio-Rad Model680)[21]。

　　1.6 产量测定收获期间摘取小区中所有的黄瓜进行产量测定(2018年10月10日开始测产，至2018年12月10日拉秧)，计算总重量，评价不同处理的产量变化。

　　1.7 统计分析数 据 分 析 采 用 SPSS16.0 软 件 的 One-wayANOVA，Tukey’s多重分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 黄瓜定植前不同氮素处理对土壤 根 结 线 虫 数量的影响

　　经过处理后土壤中线虫数的计数结果，不同 处 理 的 线 虫 数 量 均 有 所 降 低。在 等 氮 条 件下，液氨的3个处理的杀线虫能力强于氨水和碳酸氢铵。同种氮素条件下，杀线效果和氮素用量成正比。从根结线虫数量上分析，在 纯 氮 量 为123.5kg/hm2和216.0kg/hm2 的 条 件 下，虽 然 液 氨 消 毒 效 果最 好，但和氨水及碳酸氢铵的处理差异不显著。在 纯 氮 量 为 308.7kg/hm2 的 条 件 下，液 氨 处 理(375.0kg/hm2)的线虫减退率为88.5%，线 虫数量 显 著 低 于 氨 水(1695.0kg/hm2)和碳酸 氢 铵 处理(1815.0kg/hm2)。

　　2.2 黄瓜收获后不同氮素处理对黄瓜根结线虫的防治效果

　　试 验 结 果 表 明，10% 噻 唑膦 GF45.0kg/hm2处理土壤根结线虫数量最少(186.2条/100g)，根结指数最低(12.7)，其 次是 液 氨375.0kg/hm2处理，土壤 根 结 线 虫 为 240.5 条/100g，根 结 指 数为18.3，两者线 虫 数 量 没 有 显 著 差 异。在 等 氮 条件下，线虫数量依次为液氨处理<氨水处理<碳 酸氢铵处理。同样，根结指数从小到大依次为液氨 处理<氨水处 理<碳 酸 氢 铵 处 理。在 同 种 氮 素 条 件下，土壤线虫数量以及根结指数随氮素用量增大 而减小。

　　2.3 黄瓜定植前不同氮素处理对土壤微生物的影响

　　通过传统的平板检测 法 和 BiologECO 生 态板法对消毒后移栽前的土壤进行了土壤微生物分析。平板检测结果表 明，土 壤 中 可 培 养 细 菌 数 量随着液氨用量的增加而减少，随着 氨 水 和 碳 酸 氢 铵用量的增加而增加;同时，所有处理土壤中可培养细菌的数量均高于未处理对照的数量。土壤中可培养真菌的数量变化和细菌略有不同，所 有 处 理土壤中可培养真菌的数量均显著低于未处理空白对照的数量;可培养真菌数量随着液氨用量的增加而减少，随着氨水用量的增加而略有减少，随着碳酸氢铵用量的增加略有增加。

　　BiologECO 生态板的检测结果与可培养细菌的结果类 似。AWCD(590nm)、Shannon 指数、Simpson指数和 McIntosh指数均随着液氨用量(LA150.0，LA262.5和 LA375.0)的 增加 而 减 少，随着氨水(AW678.0，AW1186.5和 AW1695.0)和碳酸氢铵用量(AB726.0，AB1270.5和 AB1815.0)的 增加而增 加。除 了 液 氨 375.0kg/hm2 (LA375.0)，其他 处理 的 AWCD(590nm)、Shannon指 数、Simp-son指 数 和 McIntosh 指 数 均 高 于 CK(对 照 处理)，特 别 是 氨 水 1186.5kg/hm2 (AW1186.5)，氨 水 1695.0kg/hm2 (AW1695.0)和 碳 酸 氢 铵1815.0kg/hm2(AB1815.0)处 理，不 同 指 数 均 显著高于对照处理。平 板 检 测 法 和 BiologECO 生 态板法的结果综合表明，3种氮素的土壤消毒处理，对土壤细菌具有一定促生作用，对土 壤 真 菌 具 有 更 好的抑制作用。

　　2.4 不同氮素处理对黄瓜收获后土壤微生物的影响

　　对黄瓜收获后的土壤进行了平板检测和 BiologECO 生态板法 检 测，结 果 表 明，不 同 氮 素 消 毒 处 理的可培养细菌和真菌数量都要显著高于噻唑膦处理(噻唑 膦 GF)和 空 白 对 照(CK)。等 氮条 件下，液氨处理具有比氨水和碳酸氢铵处理更高的细菌和真菌数量。同种氮源条件下，氮素剂量越高，可培养细菌和真菌数量越高。BiologECO 生态板的检测结果和可培养微生物 的 检 测 结 果 类 似 。

　　AWCD(590nm)、Shannon指数、Simpson指数和 McIntosh指数均随着氮素 用 量 的 增 加 而 增 加。所 有 处 理 的 AWCD(590nm)、Shannon指数、Simpson指数和 McIntosh指数均高 于 CK(对 照 处 理)，且 LA262.5 处 理(液 氨262.5kg/hm2)，LA375.0处理(液氨375.0kg/hm2)、AW1186.5处 理(氨水1186.5kg/hm2)、AW1695.0(氨 水 1695.0 kg/hm2 )和 AB1815.0(碳 酸 氢 铵1815.0kg/hm2)处理的所有指数均显著高于对照处 理。平 板 检 测 法 和 BiologECO 生 态 板 法 的 结果 综 合 表 明，3 种 氮 素 也 可 以 作 为 土 壤 氮 源 的 一种，对 土 壤 微 生 物(细 菌 和 真 菌)具 有 一 定 的 促 生作 用。

　　3 结论与讨论

　　土壤化学消毒是最直接和有效的土壤病害处理方法，可以起到较好的控制土壤有 害 生 物 和 增 产 作用[23]，但土壤 消 毒 剂 一 般 成 本 较 高，对 产 品 的 推 广应用造成了一定的影响[19，24]。液氨、氨水和 碳 酸 氢铵3种氮源既是氮肥又是土壤消毒剂，对 土 壤 中 的病虫害都具有一定的防治效果，同时价格比较便宜。本研究对这3种氮源进行土壤根结线虫的防治研究发现，这3种氮源都具有一定的根结线虫防治效果，特别是液氨在375.0kg/hm2 消毒用量条件下，可以起到和10%噻唑膦 GF(2g/株，45.0kg/hm2)用量下类似的杀线效果和增 产 效 果。

　　在 等 氮 条 件 下，液氨处理的杀线和增产效 果 最 好。相 同 氮 源 条 件 下，杀线效 果 和 增 产 效 果 与 氮 源 用 量 成 正 比，液 氨 在375.0kg/hm2 用量条 件 下，杀 线 和 增 产 效 果 最 好。因此，液氨、氨水和碳酸氢铵这3种氮源都具有杀线增产的应用前景。常用的土壤化 学 消 毒 均 为 一 类 灭 生 性 的 方 法，对土壤生物靶标无选择性，对土壤 中 的 微 生 物 是 毁灭性的触杀，所以对土壤生态破坏严重[25]。有研究表明，使用氯化苦会降低土壤中细 菌 和 真 菌 群 落 的多样性，使用威百亩对土壤微生物也有显著影响，同时减弱碳、氮矿化等重要的土壤转化过程[26-27]。本研究采用传统的平板法和 BiologECO 生 态板 法 对3种氮源对土壤微生物数量和微生物群落水平生理特征(CLPP)进行了测定。平板结果发现，消毒后细菌数量随着液氨用量的增加而下 降，随 着 氨 水 和 碳酸氢铵用量的增加而增加，但所有 氮 源 处 理 细 菌 数量都要高于对照。

　　平板对真菌的检测发现，3种氮源对土壤真菌都具有显著的 灭 除 作 用，这 可 能也是 3 种氮源可以用来防控多种真菌病害的原因[6，14-15]。黄瓜收 获 后，平 板 分 析 结 果 表 明，所 有氮源处理土壤中的细菌和真菌数量都显著高于对照处理和10%噻唑膦 GF处理，而且细菌和真菌的数量都随氮源用量升高而升高，这说 明 不 同 氮 源 处 理最终对土壤微生物的数量有促进作用。BiologECO 技术主要是通过平均颜色变化率(averagewellcolordevelopment，AWCD)和多样性指数等多个指标来分析微生物对多种碳源的利用情况，从而反映微生物群落代谢功能的多样性特征[28-29]，可以有效弥补传统平板法只能检测可培养微生物数量的缺陷[30]。

　　本研究中，BiologECO 生态板 的 检 测结果同 平 板 检 测 细 菌 结 果 类 似，消 毒 后 AWCD 值，Shannon多样性指数，McIntosh多样性指数和 Simp-son优势度指数随着液氨用量的增加而降低，随着氨水和碳酸氢铵用量的增加而增加。黄瓜收获后，所有氮素处理的 AWCD 值、Shannon多样性指数、McIntosh多样性指数和 Simpson优势度指数均高于空白对照和10%噻唑膦 GF处理，同时不同指数均和氮素的用量成正相关。这同平板检测结果相似，都说明所有氮源处理最终对土壤微生物生态群落没有破坏作用，反而有增强的作用。综上可知，氮 素 消 毒(液 氨、氨 水 和 碳 酸 氢 铵)可以有效控制土壤中根结线虫引起的危害，可以 有效保护土壤微生物菌落及土壤生态环境，且成本 远低于噻唑膦等化学杀线虫剂，适于在生产上推广 应用，为未来的土壤病害防治和生态保护提供了支持。

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　　作者：左 强， 武凤霞， 张淑彬， 邢礼军， 李吉进， 肖 强* ， 刘建斌