现代诊断与治疗期刊发表浅谈丹酚酸提取工艺

　　摘要：丹参水溶性有效成分多具有酚酸性结构,丹参素(化学名为β?3,4?二羟苯乳酸,β?3,4?dihydroxybenyl lacticacid)是各种丹酚酸的基本化学结构:丹酚酸A是一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成;丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成;丹酚酸C 则为二分子丹参素缩合而成;其他丹酚酸亦有类似结构。丹参水溶性成分中的迷迭香酸(ros?marinic acid A,Ros)也是由一分子丹参素和一分子咖啡酸缩合而成。此外,还有四甲基丹酚酸(tetramethyl salvianolic acid A,Sal M)等等[1]。

　　目前, 工业上提取丹参有效成分主要以热回流法为主,而酚酸类性质不稳定、易氧化水解,因而提取工艺的研究应多指标综合考虑。选择不稳定成分作为提取工艺筛选的指标性成分,有利于筛选出合理的工艺条件,防止成分在提取工艺中损失过大[2-3]。本研究以提取物得率和丹酚酸B含量为指标,进行丹酚酸提取工艺研究, 以确定最佳的提取工艺,探索适合工业化提取的工艺条件。

　　关键词：现代诊断与治疗期刊征稿,期刊投稿,丹酚酸,提取工艺

　　1 仪器与试剂

　　1.1 仪器

　　FA1004N型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司),JZ8002天平(上海精密科学仪器有限公司),RE5298A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),LXJ?II型离心沉淀机(上海医用分析仪器厂),YL?015型实验型喷雾干燥机(上海雅程仪器设备有限公司),QT?330型柱温箱(QM,旗美),LC?10ATVP型泵(日本岛津),SPD?10AVP型紫外检测器(日本岛津),高效液相色谱柱(Diamonsil 钻石),电子天平(SHIMADZU AY120),KQ?100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),pHS?25型pH计(上海智光仪器仪表有限公司)。

　　1.2 试药与试剂

　　丹参药材系唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎(购自广州市天河宝润堂中药饮片厂),经广州中医药大学高英主任药师检验,符合《中国药典》2005版一部丹参项下规定。乙醇(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司),甲醇、乙腈(色谱纯,迪马科技有限公司),甲酸(分析纯,广州化学试剂厂),D101大孔吸附树脂(天津市光复精细化工研究所),盐酸(分析纯,广州市白云区良田光明化工厂), FeCl3(分析纯,天津市大茂化学试剂厂),丹酚酸B对照品(批号:200504,中国药品生物制品检定所)。

　　2 方 法

　　2.1 丹酚酸提取工艺

　　2.1.1 实验设计 采用均匀设计法,选择影响醇提的3个主要因素:乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取温度(C)为考察指标,乙醇浓度选择9个水平,提取时间及提取温度各选择3水平、各水平循环3次,采用U9(96)表安排试验,见表1。表1 因素水平表

　　2.1.2 样品溶液的制备 取丹参药材100 g,加入3 000 mL的圆底烧瓶中,按表1实验列号各条件操作,于恒温水浴锅中加热浸提,趁热抽滤,滤渣再按原条件进行第2次乙醇浸提,趁热抽滤,合并2次滤液。 将提取液用旋转蒸发仪进行减压浓缩至乙醇除尽,将浓缩液用配制好的质量分数10%的盐酸溶液调至pH=3,用离心机(2 000 r/min,5 min)离心浓缩液,用布氏漏斗抽滤,作为样品溶液备用。

　　2.2 大孔吸附树脂分离纯化

　　2.2.1 树脂的预处理 D101树脂用体积分数95%的乙醇浸泡24 h,除去上层漂浮物,湿法装柱,用乙醇流动清洗,应不时检查流出的乙醇液,至乙醇液与水混合(1∶5)不呈白色浑浊为止,然后用水冲洗至无醇味止。

　　2.2.2 丹参提取液分离纯化 离心后的样品溶液通过D 101大孔树脂(药材与树脂用量比为1∶4;流速为2.0~3.0 BV/h),用水进行冲洗,除去水溶性杂质。采用FeCl3检测法,判断洗脱液中有无丹酚酸B成分被洗脱,用水6倍量冲洗,继用体积分数30%的乙醇7倍量洗脱(流速为0.5~1.0 BV/h) 。收集体积分数为30%的乙醇洗脱液,用旋转蒸发仪(60 ℃)减压浓缩,浓缩至液体相对密度为1.15。浓缩液喷雾干燥(进风温度220 ℃,出风温度80 ℃),最终得淡黄色固体粉末。置干燥器内,备用。

　　2.3 丹酚酸B含量测定

　　2.3.1 供试品溶液的制备 精密称取丹参提取物粉末10 mg,加入100 mL量瓶中,加水溶解定容,摇匀,过0.45 μm 微孔滤膜,即得。

　　2.3.2 色谱条件 色谱柱: C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm); 流动相:甲醇?水?乙腈?甲酸(体积比30∶59∶10∶1);流速:1 mL·min-1;检测波长:286 nm;进样量:10 μL;柱温:35 ℃;

　　2.3.3 含量测定方法[4] 精密量取供试品溶液10 μL,注入液相色谱仪中,按“2.3.2”项下条件操作,测定丹酚酸B吸收峰的峰面积积分值,计算丹酚酸B含量。

　　2.4 样品的固形物含量

　　将洗脱液于60 ℃恒温水浴,挥干乙醇和部分水分成稠膏状,膏状物移至真空干燥箱(60 ℃,0.09 MPa)减压干燥,置干燥器0.5 h(防回潮),待样品冷却后,精密称量。

　　3 结 果

　　丹酚酸提取工艺正交试验结果见表2。将实验数据进行多元回归, 求得回归方程Y=1961+2.0861X1+5.4653X2-0.0356X12-2.055X22+0.0186X1X3,R2=0.954 5,F=6.150 1,方程显着有效,并得到最佳工艺参数为:乙醇浓度为45%,提取2次,每次1 h,温度为70 ℃。对最佳处方进行验证,3批样品丹酚酸B含量分别为:70.23%、69.04%、69.69%。

　　4 讨 论

　　4.1 提取丹参药材中水溶性成分丹酚酸B,大部分文献采用水提醇沉法。本文采用乙醇浸提的方法提取,其目的是为了避免用水提取时提取液中含有糖类等水溶性杂质而使液体黏稠。表2 U9(96)均匀设计表及试验结果

　　4.2 丹酚酸B对热不稳定,易氧化水解,对受热温度和受热时间敏感,所以丹参提取液不宜长时间高温浓缩。试验结果表明,丹酚酸提取宜采用减压浓缩和喷雾干燥等工艺,降低工艺过程的温度和受热时间,有利于提取物中丹酚酸保存率的提高[4]。

　　4.3 将浓缩液pH值调至3,可以使部分杂质析出,且酸性体系有利于丹酚酸B水溶液在受热条件下的稳定;同时调节溶液的pH可以改变丹酚酸在溶液中的游离状态,酸性条件下丹参酚酸的极性下降,有利于大孔吸附树脂对丹酚酸的吸附。

　　4.4 以体积分数为95%的乙醇湿法装柱,清洗,然后用水冲洗,冲洗速度宜慢,使大孔树脂堆实以利于吸附药液;药液通过D 101大孔树脂,流速控制为树脂体积2.0~3.0 BV/h,这样可以使药液与树脂充分接触,静置一段时间再用水进行冲洗,洗脱糖等水溶性杂质,而丹酚酸B类成分未被洗脱。用体积分数为30%的乙醇洗脱,丹酚酸B具有良好的解吸附性。