植物病毒纳米颗粒在医学领域中的应用

　　摘要植物病毒粒子作为纳米级颗粒，具有在植物细胞内积累水平高、再生成本低、纯化工艺简单及对人体安全等优点，是一种理想的天然纳米材料。随着生物纳米技术的发展，植物病毒纳米颗粒在医学领域展现出越来越大的应用潜力，本文围绕靶向传递药物、分子成像和疫苗制备综述了植物病毒纳米颗粒在医学领域的研究进展和应用。

　　关键词植物病毒;纳米颗粒;成像;疫苗;药物传递

　　0引言

　　近年来，可用于癌症治疗的各种能够输送药物的纳米载体在医学中应用备受关注，相较于传统的药物递送平台，纳米载体具有较大比表面积而容纳更多药物或标记物，并可通过修饰连接特殊配体来增强其靶向性。目前有多种人工合成纳米载体，如，合成聚合物、脂类、碳纳米管等[1-2]在载药量、靶向传递能力、稳定性等方面各有优缺点，考虑到毒性和对环境的影响，目前研究者们更多地集中在一些天然的纳米载体材料上，如，噬菌体MS2、小型热休克蛋白、铁蛋白、病毒纳米颗粒(Viralnanoparticles,VNPs)等[3-5]。

　　医学论文范例：临床医学检验重要环节的质量控制研究

　　自然界中病毒，具有纳米级大小、高度对称三维蛋白结构、良好生物相容性和水溶性、可进行各种遗传/化学修饰等优点，在医学领域有着巨大应用潜力。来源于植物的病毒不会感染人畜，相比较于动物病毒更加安全[6]。本文将主要从靶向传递药物、分子成像和疫苗制备三个方面，综述植物病毒纳米颗粒在医学领域的研究进展。

　　1在靶向传递药物方面的应用

　　相比较于口服，利用纳米载体输送药物能提高药物分子的局部浓度，减少药物吸收时的损失[6]。植物病毒粒子作为纳米材料，可以连接或包埋药物，用于疾病的治疗。Shriver等[12]以豇豆花叶病毒(Cowpeamosaicvirus,CPMV)为载体，成功向受损中枢神经系统递送治疗药物。递送药物时，载体在体内循环时间越长，药物在靶向组织中积累量越高[13]，而载体在体内滞留时间与载体表面所带电荷以及表面是否修饰有关[14]。

　　运输药物的载体多为小分子纳米材料，但带有负电荷的纳米载体在体内半衰期短[3,15]。聚乙二醇修饰，不仅能够增加纳米载体的稳定性和溶解度，还能减少纳米载体与体内蛋白或细胞相互作用，使得其在生物体内的半衰期提高、稳定性增加和免疫原性降低[16]。基于马铃薯X病毒(otatovirusX,PVX)和CPMV制备的病毒样粒子经聚乙二醇修饰后降低免疫原性;经动物实验证实，修饰后病毒粒子在小鼠的肿瘤部位渗透更强、积累更多，更有利于抗癌药物的递送和成像[17]。

　　肿瘤细胞表面蛋白可作为标记物，用于区分肿瘤与正常组织[8-10]。植物VNPs连接上肿瘤标记物后在运输药物可直接靶向肿瘤而不影响其它正常组织，如F56肽能与血管表皮生长因子受体1(Vascularepithelialgrowthfactorreceptor,VEGFR-1)特异性结合，在移植有人类结肠癌细胞的小鼠模型中，表达F56肽的CPMV纳米颗粒能够靶向于高表达VEGFR-1的肿瘤细胞[11]，在一定程度上减少了药物的副作用。植物病毒纳米颗粒外壳蛋白(Coatprotein,CP)中有许多裸露氨基酸残基，如，赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等，可通过化学修饰方法与抗体、寡核苷酸、药物或其它小分子连接起来[18-19]，从而使病毒粒子功能化。

　　Wang等[20]通过N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimideester)将荧光素或生物素结合在CPMV表面，使得CPMV能用于成像或定位。在各种形态的植物病毒中，二十面体的植物病毒粒子具有较大的内部空间，是目前研究最多的用于装载小分子物质的载体[21]。通过改变溶液的金属离子浓度和pH值，二十面体植物病毒CP的间隙逐渐增大[22]，药物通过孔隙扩散到病毒内部，逆转条件，CP的间隙重新缩小，最终将药物封装在内。

　　Ren等[21]以二十面体木槿褪绿斑驳病毒(Hibiscuschloroticringspotvirus,HCRSV)为载体封装抗癌药物阿齐霉素，制备成直径约30nm的蛋白笼，并在病毒粒子的表面连接上叶酸，赋予其靶向肿瘤的能力，改造后的HCRSV能将更多的药物输送到肿瘤部位，增强疾病治疗效果。黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)[23]、CPMV[24]、红三叶坏死花叶病毒(Redclovernecroticmosaicvirus,RCNMV)[25]等也被证实能够随着pH值变化而改变病毒粒子构象，从而将相关药物封装于内部。除了通过改变pH值改变植物VNPs构象外，一些药物还可以与植物VNPsCP内表面的带电荷氨基酸残基，或腔内带负电荷的核酸，通过静电相互作用被包封在植物VNPs的内腔[7,26]。

　　病毒CP中部分带电荷氨基酸残基对核酸有较强亲和性，能够稳定包裹遗传物质，具有传递基因药物的潜力[27]。豇豆褪绿斑驳病毒(Cowpeachloroticmottlevirus,CCMV)已被证实可高效地自发封装许多长单链RNA，并将其在相应位置释放[28]。Azizgolshani等[28]研究发现，CCMV的CP与异源RNA体外自组装而成的杂合病毒颗粒，能够在哺乳动物细胞的胞质中释放异源RNA。植物VNPs的CP作为坚固的外部支架，能够保护其封装的基因药物不受核酸酶降解的影响，且具有进一步功能化和细胞靶向的可能，为相关疾病的基因治疗提供了可行的方案。

　　2在成像方面的应用

　　修饰方法的多样性和精确装配的优势使得植物病毒纳米颗粒能够用于制备成像探针。目前，植物病毒纳米颗粒已被用于光学成像、磁共振成像(Magneticresonanceimaging,MRI)和正电子发射断层扫描[29]。在成像过程中，清除携带成像试剂的载体滞留组织所引起的毒性至关重要，与一些需要数月才能清除的合成纳米材料(碳纳米管、金颗粒和二氧化硅)相比，植物病毒纳米颗粒易从体内清除，且半衰期短，大大降低了纳米载体滞留对机体产生的毒性[13]。

　　荧光成像是目前肿瘤评估的重要方式，荧光剂可以通过生物偶联、基因工程和自组装等方式整合到植物病毒CP上[29]。在使用流式细胞术研究细胞特异性颗粒摄取、通过共聚焦显微镜观察颗粒定位以及通过体内成像确定生物分布的过程中，荧光展现出至关重要的作用[30]。CPMV连接荧光分子Oregongreen-488制备而成的病毒荧光探针可用于检测CPMV在活体小鼠体内的循环路径，口服数天后，可在小鼠体内的肾、肺、胃、空肠、回肠和大脑等组织检测到CPMV，且从小鼠组织中回收的病毒纳米颗粒结构并未受到破坏[31]。

　　在烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)纳米颗粒CP的内表面连接近红外荧光染料和镝(Dy3+)，外表面连接天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸，制备的纳米颗粒具有良好生物相容性和较低细胞毒性，在体内和体外都能够靶向前列腺癌细胞PC-3[32]，为植物病毒用于癌细胞的检测提供了可行性。活体血管成像是一种强大的工具，可用于无创检测和可视化疾病。常用的成像试剂载体有纳米球[33]、氧化铁颗粒[34]和脂质体[35]等，但存在稳定性、毒性或生物利用度等缺陷，且分辨率和穿透深度还有待提升。植物VNPs表面有多个化学试剂反应位点，且具有良好的生物相容性和惰性，使得植物VNPs成为一种优良的荧光染料多价展示平台。植物VNPs能与血管内皮细胞表面的蛋白相互作用[7,36]，可用于标记血管，进而用于生物体内部组织的成像。

　　高密度偶联荧光染料的CPMV可以在鸡胚和活鼠中显示血管系统和血流，深度可达500μm，持续时间长达72h，分辨率优于类似大小的荧光纳米球[31]，荧光标记CPMV还能可视化人纤维肉瘤导致的肿瘤血管[31]。植物VNPs直径大多在5~100nm之间，具有较大的比表面积，能够承载数以百计的钆离子，刚性分子结构和较大的扭转系数使得植物VNPs能够提供很高的弛豫度，因此，植物VNPs表面经钆离子修饰后，可用于制备MRI造影剂[37-38]。

　　3在疫苗制备方面的应用

　　3.1肿瘤疫苗

　　肿瘤疫苗是指通过表达特异性的、有免疫原性的肿瘤抗原，在细胞因子、趋化因子等佐剂的辅助下，激活或加强患者自身的免疫系统，进而杀伤、清除肿瘤细胞;与化疗相比，肿瘤疫苗具有副作用小、避免耐药性和诱导长期免疫等优点，是近年的研究热点之一[37]。

　　2010年4月，美国食品药品监督管理局(Foodanddrugadministration,FDA)批准Provenge/sipuleucel-T用于治疗晚期前列腺癌，Provenge/sipuleucel-T是世界上第一个依靠自体主动免疫的治疗性癌症疫苗，为其它同类产品的研发铺平了道路[38]。

　　3.1.1多肽疫苗

　　在过去的二十年中，植物VNPs作为外源多肽和蛋白表达载体的研究正逐渐兴起。植物VNPs，尤其是来自CPMV或TMV的纳米颗粒有望成为多肽疫苗研发的平台[39-40]。多个抗原分子有序排列可有效调控免疫细胞的活性，进而诱导机体产生特异性免疫反应，无包膜植物VNPs的CP亚单位在三维空间上排列规则而有序，能够在纳米尺度上精确的展示和排列功能性结构单元，使植物VNPs成为抗原和/或半抗原的理想表达载体[40-41]。

　　植物VNPs可通过化学交联剂与多肽或完整的蛋白质抗原相连接，交联剂与植物VNPs表面的反应性基团特异性结合，从而将连接的抗原展示在病毒颗粒表面[41]，该方法对抗原表位的大小没有限制，且可进行多价展示，将多种不同的抗原表位同时暴露在一个病毒颗粒的表面[42]。目前已有多种螺旋状的植物病毒通过化学连接的方式在表面展示外源多肽，如Shukla等[43]将来源于人表皮生长因子受体2(Humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER2)胞外结构域的P4肽与PVX连接，制备成HER2疫苗，该疫苗免疫小鼠后能检测到HER2特异性抗体，克服机体对HER2的免疫耐受，有望应用于乳腺癌的预防和治疗。

　　4总结

　　植物病毒作为一种天然的纳米材料，可以靶向传递药物，易生物降解，对人体安全，便于修饰和改造，在医学领域有着巨大的应用潜力。植物病毒在植物细胞内高水平积累，再生成本低，纯化工艺简单，对于发展中国家而言，是生产安全廉价疫苗的良好选择[56]。植物病毒具有穿透实体肿瘤的能力，在应用于肿瘤治疗的各种纳米载体中有着巨大的优势。药物可以修饰在植物病毒的表面或包封于内腔，靶向疾病部位后能够提高药物的局部浓度，达到增强疗效和延长半衰期的效果。植物病毒还能通过基因修饰或化学连接的方式在CP上展示肿瘤抗原，通过修饰加上配体，则能制备成靶向性更强的肿瘤疫苗，更好地激发机体抗肿瘤免疫。

　　多种植物VNPs和缺乏遗传物质的病毒样颗粒已被证实能在多种肿瘤模型下诱发强大的局部免疫，不同形态的植物VNPs会引发不同类型的免疫反应，因此，深入研究不同植物VNPs激活免疫的分子机制，明确其作用途径和靶点，挑选出最有效的植物病毒种类，使得该技术从实验室研究到临床应用转化成为可能。此外，植物病毒还能连接荧光物质，用于制备成像试剂。综上所述，植物VNPs有着诸多优势，在医学领域有着广泛的应用前景，目前，植物VNPs在药物靶向治疗和分子成像领域已有较多研究，但在疫苗领域还处于早期探索阶段，需要进一步研究来推动纳米疫苗的制备。

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　　作者：杜志游，周昀茜，董温昕